Bioquimica

PRACTICA 2

DEMOSTRACIÓN DEL ALTO PODER CATALITICO DE LA AMILASA SALIVAL


INTRODUCCIÓN.


La hidrólisis del glucógeno (ó almidón) puede ser catalizada por ácidos ó por enzimas. En la hidrólisis catalizada por ácidos hay un rompimiento desordenado de enlaces, con la formación intermedia de todos los posibles oligosacáridos y con la conversión final de estos oligosacáridos a glucosa. Lasenzimas son más específicas con respecto a los enlaces rotos, por ejemplo la alfa-amilasa cataliza la hidrólisis rápida y ordenada de enlaces internos alfa(1-4) y no hidroliza los enlaces alfa(1-6), ni maltosa; La alfa-amilasa actúa rompiendo el glucógeno inicialmente en dextrinas ramificadas de peso molecular mediano, formando solamente pequeñas cantidades de maltosa; posteriormente disminuye elpeso molecular de las dextrinas, a través de rompimientos relativamente lentos dando glucosa y un oligosacárido con un residuo de glucosa menos. Los productos finales de la degradación son: glucosa, maltosa e isomaltosa.

Debido a que durante la hidrólisis, ya sea catalizada por ácidos ó por alfa-amilasa, hay un incremento de grupo reductores, el progreso de la reacción puede ser observadomidiendo la cantidad de azúcares reductores por reducción del 3,5-dinitro salicilato. El grado ó porcentaje de hidrólisis se determina comparando la cantidad del azúcar reductor formado en un tiempo dado con la cantidad del azúcar presente después de la hidrólisis acídica total

PRODUCTO BIOLÓGICO

Saliva humana obtenida al momento de realizar la práctica.


MATERIAL YEQUIPO

 8 tubos de ensaye de 18x150
 1 gradilla
 6 pipetas serológicas de 1 ml, 5 ml y 10 ml
 1 vaso de precipitado de 50 ml
 1 vaso de precipitado de 500 ml
 Plancha de calentamiento
 Espectrofotómetro
 Cuba para espectrofotómetro

REACTIVOS

 Glucógeno de hígado de rata
 HCl 2 N
 NaOH 1.2 N
 Reactivo de 3,5-dinitro salicilato
 Amortiguador de fosfatos 0.02 M pH=6.9
NaCl 0.005 M


TÉCNICA


A-. HIDRÓLISIS ÁCIDA

1. Preparación de la solución de glucógeno:
Disolver 40 mg de glucógeno de hígado de rata en 5 ml de agua destilada (esta solución es de 8 mg/ml). (Nota 1)

2. Hidrólisis del glucógeno:



Numerar 8 tubos de 18x150(del 1al 8), y agregar lo siguiente:

TUBO NÚMERO
REACTIVO (ML) 1 2 3 4 5 6 7 8
Agua destilada 0.1 - - - - - - -
Soln deglucógeno - 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
HCl 2 N 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
NaOH 1.2 N 1 1 - - - - - -


3. Introducir los tubos del 3 al 8 en baño de agua hirviendo.

4. retirar los tubos del 3 al 8 del baño de agua hirviente a intervalos de 3 minutos cada uno y neutralizar inmediatamente añadiendo a cada tubo 0.1 ml de NaOH 1.2 N

5. después de 25 minutos retirar el tubo 8 delbaño de agua hirviente y añadir inmediatamente 1 ml de NaOH 1.2 N.

6. Añadir a todos los tubos (del 1 al 8), 1 ml del reactivo de 3,5 dinitrosalicilato e introducirlos en baño de agua hirviente por 5 minutos.

7. Sacar los tubos del baño de agua e introducirlos inmediatamente baño de agua con hielo. Una vez fríos, añadir a cada tubo 15 ml de agua, mezclar por inversión y medir la absorbancia decada tubo a 540 nm utilizando el tubo 1 como blanco.

B-. HIDRÓLISIS ENZIMATICA.
1. recolección de la saliva.

El voluntario debe enjuagarse perfectamente la boca con agua y masticar un pequeño fragmento de parafina limpia para estimular la producción de la saliva. Recoger 2 ml de saliva en un vaso de 50 ml. Cuando todo este listo para la hidrólisis enzimática preparar una dilución de 1:80,1:10 ó 1:15 de ésta saliva. Utilizar la saliva para la hidrólisis inmediatamente después de diluida. (Nota 2)


2. Preparación de la solución de glucógeno.
Disolver 32 mg de glucógeno de hígado de rata en 4 ml de NaCl 0.005 M (el ión cloruro activa la alfa-amilasa). (Nota 3)

3. Hidrólisis del glucógeno.
Numerar 8 tubos de 18x150 (del 1 al 8), y añadirles lo siguiente:



TUBO...