bioquimica

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS





















Laboratorio de Bioquímica General
Manual de prácticas














Dr. Isaías Balderas Rentería
Dra. Mónica Noel Sánchez González










PRÁCTICA No. 1
Determinación de la actividad de la -amilasa

INTRODUCCIÓN
Las enzimas amilasas son hidrolasasproducidas en el humano por el páncreas y las glándulas salivares que degradan el glucógeno y el almidón presentes en los alimentos para producir azúcares simples. Fue la primer enzima identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien originalmente le puso el nombre de diastasa aunque actualmente este nombre se usa principalmente para las alfa amilasas extraídas de cereales. Algunas otrasfuentes de esta enzima son los hongos (Aspergillus oryzae) las bacterias (Bacillus stearothermophilus y subtilis) y como se mencionó, los cereales.

Estas enzimas requieren iones cloruro para actuar ya que se inactivan totalmente en ausencia de ellos. Pueden actuar en cualquier parte de la cadena larga de polisacárido rompiendo el enlace alfa 1,4 y produciendo maltotriosa y maltosa a partir de laamilasa y maltosa, glucosa y dextrina a partir de la amilopectina. Su pH óptimo está entre 6.7 y 7.0, volviéndose totalmente inactivas a pH de 3.3.

Son empleadas para romper los azúcares complejos de la harina en azúcares simples durante la fabricación de pan, de tal manera que la levadura pueda asimilar los monosacáridos y metabolizarlos a productos de la fermentación. Este proceso, además dedarle el típico sabor al pan, hace que la masa se infle. Aunque las levaduras contienen estas enzimas, necesitan tiempo para producir la cantidad suficiente por lo que para determinadas masas, se añade amilasa para facilitar y acelerar estos fenómenos. Por otro lado, en algunos procesos industriales se utilizan amilasas bacterianas como detergentes para disolver determinados almidonescontaminantes.

Objetivo: El alumno aprenderá a medir la actividad de una enzima comercial.

Almidón 4%
Buffer fosfatos pH 6, 100 mM
Solución de -amilasa 1 U/ml en buffer fosfatos
Ácido dinitrosalicílico (DNS), 300 mL
Estándar de glucosa 0.2%
Baño 60°C
Baños con hielo
Plancha de calentmiento
15 tubos de ensaye 18x150
Vaso de precipitados de vidrio de 1 o 2 L
Gradilla para tubos de ensayoReactivo
Reacción
Blanco enzima
Std 1
Std2
Std3
Std4
Std5
Buffer
2.5
2.5
2.5
3
3.5
4
4.5
Enzima
5
5





Almidón
2.5
0





Agua
0
2.5
5
5
5
5
5
STD glucosa
0
0
2.5
2
1.5
1
0.5

Montar la reacción por duplicado e incubarla a 60°C, tomar 1 mL de muestra cada 10 minutos por una hora. Para inactivar la reacción las muestras tomadas son inmediatamentedepositadas en otro tubo que contiene 3 mL de DNS

Una vez terminada la reacción, las muestras con el DNS se calentarán a ebullición por 5 min.
Los tubos se enfriarán en hielo, se les agregará 1 mL de agua destilada y se medirá la densidad óptica a 540 nm.

Preparación de DNS. 5 gramos de ácido 3,5-dinitrosalicílico,se disuelven en 10 mL de agua destilada. A esta solución se le agregalentamente y con agitación contínua 100 mL de una solución 2M de hidróxido de sodio. Adicionar 250 mL de agua y agitar hasta disolver completamente. Posteriormente agregar lentamente 150 g de tartrato de sodio-potasio y agitar hasta disolver, si es necesario calentar LIGERAMENTE. Aforar la solución final a 500 mL co agua. Si quedan sólidos filtrar.
Esta solución es estable por seis meses si se almacenaen una botella ámbar protegida con papel estaño en el exterior y entre 15 y 25°C.

Reporte:
¿Describa la reacción que cataliza la a-amilasa?
¿Por qué se utiliza DNS?
¿Por qué se utiliza la curva estándar?
Reportar la actividad de su preparación enzimática

Disposición de reactivos
DNS: recipiente especial (preguntar en almacén)
Mezcla de reacción Colector A
Residuos vegetales...