Bioquimica

PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA CURVA ESTANDAR Y DETERMINAR LA PROTEINA EN LAS MUESTRAS EXPERIMENTALES:

1. Diluya en reactivo de Bradford 5x 4:1 con agua desionizada y filtre en papel whatman del#1.

2. Consiga una cámara de 96 pozos (placa para ensayos de ELISA) de fondo plano.

3. Prepare los estándares (ver el cuadro mas abajo)

4. Coloque los estándares por triplicado. El cero oblanco corresponde a la primera fila.

5. Añada el volumen suficiente de agua desionizada hasta completar 100 µL

6. Pipetee 100 uL del reactivo de Bradford 1 X. 7.Incube por 5 minutos a temperaturaambiente.

8. Lea a 595 nm.

9. Grafique sus resultados (los ejes son comúnmente denominados como Y = A, 595 nm y X = µg/µL o mg/mL). Use la curva para determinar la concentración de proteínas enlas muestras experimentales.


CURVA ESTANDAR

Preparar una solución patrón de Albúmina Serica Bovina (BSA, Sigma Chem.) 1 mg/mL, a partir de esta solución se tomaran las muestras para prepararlos estándares de referencia, con ellos se construye la curva de referencia o curva estándar la cual tiene valores conocidos y con los que se comparara con las muestras experimentales para determinar enella la concentración de proteína total. Use de preferencia la proteína que más se asemeje a lo que se desea medir (e.g. gamaglobulina, albúmina, etc.) Para BSA, use valores de 0 -50 µg como susestándares para la curva de calibración. Para determinar la concentración de IgG, use 0-160 µg.

* Nota: La BSA no es muy buen estándar para este método, a pesar de ellos puede ser empleado sinproblemas. Lisozyma u ovoalbumina y catalasa son mucho mejores.

Leer en espectrofotometro de placa a 595 nm


CURVA DE CALIBRACION

BSA (1 mg/mL) *Buffer o H2O desionizada **Reactivo de BradfordTodo en µL (microlitros)

BSA 0 µL Agua * 100 µL Reac Brad ** 200 µL
2 * 98 ** 200
4 * 96 ** 200
8 * 92 ** 200
12 * 88 ** 200
16 * 84 ** 200
20 * 80 ** 200

Muestra experimental
5 * 95 **...