Bioquimica

La fracción se puso en una columna de fenil-Toyopearl 650M (1x5cm) tampón de equilibrado wiht de 50 mM de citrato de sodio (pH 4,0) que contiene 200 mM Na2SO4, 0,1% de MS, y EDTA 1 mM. La columna se lavó con el mismo tampón a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min. Actividad oxidante ubiquinol se eluyó en estas condiciones. La fracción activa (17,85 ml) se concentró hasta aproximadamente250microL por Centricut (Centricut V-10 de Kurabo, Oksaka, Japón) y se puso en una columna TSKgel G3000SW equilibró la pizca de 50 mM de tampón de citrato de sodio (pH 4,0) que contiene 0,05% de MS y 50 mM Na2SO4 . La elución se realizó con el mismo tampón a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min. Las fracciones activas se eluyeron después de aproximadamente 25 min y se combinan. La fracción (2,4 ml) seconcentró hasta aproximadamente 100microl por Centricut, y luego volvió a cromatografiar en una columna TSKgel G3000SW en las mismas condiciones que antes.
electroforesis .electroforesis en gel de poliacrilamida ( PAGE natural ) de la muestra , no desnaturalizado, se llevó a cabo en gel de acrilamida al 10 % ( pH 4,3 ) por el método de Gabriel . DM fue añadido al gel de poliacrilamida a laconcentración final de 0,1 % . Después de la adición de 10 microlitros de la solución de DM 10 % y de 0,4 % 2microL pironina G para 4microL de la muestra , nativo -PAGE en presencia de DM se hizo a cabo en una corriente de 2 mA por tubo durante aproximadamente 20 h en 17,5 mM de beta - alanina - tampón de acetato ( pH 4,5 ) Después de la electroforesis , el gel se tiñó un poco con 0,25 % azul brillantede Coomassie R - 250 solución que contiene 9,0 % de etanol y 2,0 % overninght ácido acético , y se decoloró con una solución que contiene 25 % de etanol y ácido acético 8,0 % Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil-sulfato de sodio ( SDS-PAGE ) se llevó a cabo en geles de acrilamida al 12,5 % por el método de Laemmli . Una enzima purificada se incubó wiht mismo volumen desolución que contiene SDS ( 10 % ) , 2 - mercaptoetanol ( 16,7 % ) , glicerol ( 16,7 % ) , y 83.3mM tampón Tris - HCl ( pH 6,8 ) a 30 ° C durante 3 h antes de que se llevó a cabo en SDS-PAGE . La lisozima ( M14.400 ) , inhibidor de tripsina ( 20.100 m ) , anhidrasa carbónica ( M30.00 ) , adolase ( M 42.400 ) , albúmina de suero bovino ( M66 , 267 ) , y la fosforilasa b ( M97 , 400 ) se utilizaroncomo los marcadores . SDS-PAGE era en un gel de poliacrilamida al 12,5 % durante aproximadamente 2 horas a una corriente de 20 mA. Después de la electroforesis, el gel fue teñido con 0,25% de azul brillante de Coomassie R-250 solución que contiene 9,0% de etanol y ácido acético al 2,0% durante la noche, y se decoloró con una solución que contiene etanol al 25% y ácido acético al 8,0%
Medición delespectro. espectros de la enzima se midió por un Backman DU65 espectrofotómetro con una celda de 1 cm de luz camino a temperatura ambiente. Una muestra se oxida con el aire, y la reducción de hidrosulfito de sodio wiht. El espectro de diferencia menos reducida CO-reducido de muestra se obtuvo mediante un espectrofotómetro Beckman DU65 con una celda de paso 1 cm de la luz a temperatura ambiente.Espectro de diferencia de CO se preparó como sigue; una línea de base fue memorizado con la enzima reducido con hidrosulfito de sodio, y a continuación, el espectro se registró después de un burbujeo a través de la solución con gas CO durante 1 min.
Medición de la proteína. proteína se midió por el Bio-Rad Dc Protein Assay, utilizando albúmina de suero bovino como el estándar.
RESULTADOSActividades de bacterias hierro-oxidantes Ubiquinol-oxidante
Ubiquinol actividades (Q2H2)-oxidantes se midieron con las membranas plasmáticas preparados a partir de varios. T cepas ferrooxidans. Se detectaron las actividades de ubiquinol-oxidantes en todas las células T ferrooxidans probado, como se muestra en la Tabla 1. Las actividades de citocromo c oxidasa, que es una oxidasa terminal de bien...