bioquimica

Materia: BIOQUÍMICA II
Práctica: AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO HEPÁTICO Y VALORACIÓN DE SU CONTENIDO EN GLUCOSA

1. ‑ FUNDAMENTO TEÓRICO

Los seres vivos almacenan hidratos de carbono en forma de polisacáridos, que sirven como materiales de reserva. El almidón, la inulina en los vegetales superiores y el glucógeno en los animales.
El glucógeno consta de unidades de glucosa unidas por enlacesglicosídicos  (1‑4) y cada 8 ó 10 unidades de glucosa se ramifica en enlace glicosídico  (1‑6).
El glucógeno es especialmente abundante en el hígado y en músculo.
Esta práctica consiste en el aislamiento de glucógeno hepático de rata y posterior determinación de la cantidad de glucosa presente en la muestra; se realiza en dos fases:
a) Extracción del glucógeno presente en una muestra detejido hepático y posterior hidrólisis ácida que despolimeriza al glucógeno y genera una disolución ácida de glucosa (hidrolizado).
b) Determinación enzimática de la glucosa presente en la disolución por el método de la glucosa oxidasa‑peroxidasa, que se fundamenta en la oxidación de glucosa a ácido glucónico por acción de la enzima glucosa oxidasa, acompañada de la formación de H2O2. El peróxidode hidrógeno formado, en presencia de la peroxidasa, produce una oxidación en la que se une el fenol con la 4-aminofenazona para dar una quinonaimina coloreada. La intensidad del color, mensurable por absorbancia, es proporcional a la concentración de glucosa presente inicialmente en la muestra (hidrolizado). Estas son las reacciones que tienen lugar:







2. ‑MATERIAL Y REACTIVOSMaterial
.‑ Tubos de ensayo de plástico translúcido
.‑ Tubos de vidrio graduados
.‑ Pipetas
.‑ Centrífuga de mesa
.‑ Varillas indicadoras de pH

Reactivos
.‑ KOH al 30%
.‑ Na2SO4 15%
.‑ Alcohol etílico
.‑ H2SO4 5N y 1N
.‑ NaOH 5N
.‑ Fenolftaleína (en etanol)
.‑ Tampón fosfato 0,2 M, pH=7.4
.‑ Solución salina de NaCl (9 g/l)
.‑ Solución patrón de glucosa (10 mg/100 ml)..‑ Solución de coloración que incluye:
glucosa oxidasa-peroxidasa, fenol, 4-aminofenazona, tampón fosfato (pH=7)



3. ‑ PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

a: FASE PRIMERA: Aislamiento de glucógeno hepático

a-1) Extracción del glucógeno de una muestra hepática.
1. ‑ Pesar aproximadamente 1 g de hígado. En el caso de hígados de animales en ayuno, se cuidará que el peso sea ligeramente superiora 1 g.

Dato Nº 1:
PESO EXACTO DE LA MUESTRA DE HÍGADO
5.18 g

Se dispone la muestra en un tubo de ensayo (de 10 ml, de vidrio o de plástico translúcido), añadir 2 ml de KOH al 30% y calentar. Introducir el tubo en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos con agitación ocasional, hasta la completa digestión del tejido (que no queden partículas en suspensión).
2. ‑ Centrifugar 5minutos a 3000 rpm para eliminar los restos de tejido no digerido.
3. ‑ Pasar cuidadosamente el sobrenadante (con una pipeta o por decantación) a un tubo de vidrio graduado, al que se le añaden 0,2 ml de Na2SO4 al 15%, y 4 ml de alcohol etílico. Agitar cuidadosamente la mezcla para poner en contacto a todos los componentes. Dejar reposar el tubo en hielo 15‑20 minutos, para provocar la precipitacióndel glucógeno extraído.
4. ‑ Centrifugar 5 minutos a 3000 r.p.m. para sedimentar el glucógeno. Desechar con sumo cuidado el sobrenadante y retener el precipitado o sedimento de color marrón‑blanco, puesto que esto es el glucógeno.

Nota.- La purificación completa del glucógeno implicaría tres o cuatro precipitaciones alcohólicas y una precipitación ácida, pero en esta práctica haremos sólo unaprecipitación alcohólica.

a-2) Hidrólisis ácida del sedimento de glucógeno
1. ‑ Al sedimento de glucógeno obtenido en el tubo graduado, se le añade 1 ml de H2SO4 5N para proceder a su hidrólisis ácida y para ello se calienta la disolución cuidadosamente a 100°C durante 45 minutos. Como el ácido puede saltar en la ebullición, es conveniente poner en la parte superior del tubo papel de filtro...