Bioquimica

PRACTICA 8
BIOQUIMICA FARMACEUTICA
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

Objetivo general
El alumno conociendo algunas de las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleícos, aplicara algunas técnicas para aislar, purificar y caracterizar ADN de diferentes tipos.

Objetivos particulares
El alumno:
• Obtendrá ADN plásmidico a partir de una cepa bacteriana.
• Purificara ADNgenómico de bacterias.
• Utilizara la técnica de electroforesis en gel de agarosa para caracterizar los diferentes tipos de ADN.

MARCO TEORICO
El primer ácido nucleico que se describió fue el acido desoxirribonucleico o ADN, el cual se aisló por primera vez en 1869, siendo objeto a partir de entonces de múltiples estudios referentes a su estructura, composición y función.

Hay dos clasesde ácidos nucleícos en los organismos vivos. El acido ribonucleico (ARN) y el ácido desoxirribonucleico (ADN).
La función biológica de los ácidos nucleícos es el almacenamiento, la duplicación, la recombinación y la transmisión de la información genética.

Los ácidos nucleícos pueden abarcar un amplio espectro de tamaños, siendo el ARN de transferencia el mas pequeño con un peso molecular de25 kDa, mientras que los ADN pueden tener un peso molecular en un rango que va de 100 000 a 1000 000 000 kDa, dependiendo del organismo del cual se aislé. Ellos pueden considerarse biopolímeros de unidades mononucleótidos, formados por una base nitrogenada: adenina, guanina, citosina y timina (en el caso de ADN) y uracilo (en el caso de ARN); acido fosfórico y un azúcar: desoxirribosa (en el ADN) yribosa (en el ARN). La mayoría de las moléculas de ADN se encuentran asociadas a nucleoproteínas que son complejos formados por proteínas básicas como las histonas.

Por lo que se refiere a la estructura del ADN, Watson y Crick, propusieron un modelo constituido por dos cadenas de ADN enrolladas helicoidalmente en torno a un eje central común, en la que los azúcares fosfato se encuentranorientados hacia la parte externa de la hélice y las bases púricas y pirimídicas hacia la parte interna, enlazándose por puentes de hidrogeno solo entre adenina y timina o entre guanina y citosina.

El ADN de un organismo determinado es homogéneo, en lo que se refiere a que en cada una de sus células se encuentra la misma cantidad y el mismo tipo de DNA. Hay una serie de propiedades físicas de losacidos nucleícos que juegan un papel importante en su aislamiento y caracterización: entre estos tenemos la viscosidad y la cromacia con luz ultravioleta.

Todos los ácidos nucleícos, nucleótidos y nucleósidos muestran una absorción característica en la región del ultravioleta. Esta absorción proviene de las bases nitrogenadas, los cuales presentan un espectro de absorción característico y único.El espectro de absorción del ADN o ARN esta dado por la suma de los espectros de las bases nitrogenadas individuales. Esta suma da una absorción máxima a 260 nm. La absorción a 260 nm va a ser proporcional a la concentración de acido nucleíco y esta propiedad se emplea en la cuantificación de los mismos.

Una de las técnicas más útiles en la separación, identificación y purificación de fragmentosde ADN, es la electroforesis en geles de agarosa. Es una técnica sencilla que se basa en la migración del ADN por acción de un campo eléctrico que actúa sobre las cargas del ADN. La agarosa es un polisacárido que al gelificar actúa como una malla de tamizaje para las moléculas de ácido nucleíco de diferente tamaño, de modo que las moléculas mas pequeñas migran mas rápido que las grandes y estopermite la separación de las moléculas de acuerdo a su tamaño, con tanta precisión que se puede determinar el tamaño exacto de estas mismas. La migración electroforética depende de 4 parámetros principales: a) el tamaño molecular del ADN; b) la concentración de agarosa; c) la conformación de ADN; y d) la corriente aplicada.

Material


2 Tubos de ensaye de 15 mL para cultivo
6 Tubos...