bioquimica

Metodología
Practica 6:
a) Titulación de un cultivo bacteriano.
De 1 ml de un cultivo de E.coli, se realizaron diluciones seriadas hasta alcanzar un factor de 10-5.
Siembra por rastrilleo: De la dilución, se tomo una alícuota de 0,1 ml y se sembró por rastrilleo sobre la superficie de una placa de agar LB. (LB 0, 1 ml)
Se repitió el mismo procedimiento, esta vez tomando una alícuota de0,05 ml. (LB 0,05 ml)
Siembra por agar blando: De la dilución 10-5 se tomo una alícuota de 0,1 ml y se coloco sobre un tubo Khan que contenía ya, 3 ml de agar blando. Se agito el tubo entre las palmas de las manos y se sembró en una placa de agar LB. (AGLB 0,1 ml)
Se repitió el mismo procedimiento, esta vez tomando una alícuota de 0,05 ml. (AGLB 0,05 ml)
Se dejaron incubar las placas durante24 horas, para posteriormente realizar el conteo de colonias.
b) Fenotipo y genotipo
Se tenían 10 placas, con medios diferentes; además de 4 cepas con distintas mutaciones.
Se subdividieron las 10 placas en 4 secciones identificando cada sección desde la A hasta D.
Con el fondo de la placa hacia abajo se sembró por agotamiento cada una de las 4 cepas en las secciones correspondientes, enlas 10 diferentes placas. Asi tendríamos las 4 cepas bacterianas distribuidas en 10 medios distintos y se observaría su comportamiento en cada uno.
Se dejan incubar las placas a 37 °C en posición invertida. Las placas 1,2 y 3 por 24 horas y el resto por 48.
Luego se observaría las placas y con base en la presencia o ausencia de crecimiento de cada cepa se determinaría su fenotipo. Las cepas aanalizar son las siguientes:
Cepa
Código CVCM
fenotipo
Genotipo
M1
76


CSH26
96


CSH7
71


C137
73



Los medios a utilizar son:
Medio
Tipo de
medio
B1
his
pro
gsa
lac
str
1
Nutritivo, rico






2
Nutritivo, rico





+
3
Nutritivo, rico, EMB




+

4
mineral
+
+
+



5
mineral
+
+
+
+


6
mineral
+
+

+


7mineral
+

+
+


8
mineral
+
+
+

+

9
mineral
+


+


10
mineral

+
+
+












Practica 7: transferencia de material genético entre bacterias: conjugación entre cepas Hfr, F+ y F-.
a) Mezcla conjugante:
En una fiola de 25 ml, se colocaron 5 ml de caldo LB y 4,5 ml de la cepa receptora (CSH7), inmediatamente se añaden 0,5 ml de la cepa donante Hfr eneste caso. Se dejo en reposo, evitando mover la fiola para no interrumpir la conjugación; al agregar la donante se empezó a tomar el tiempo para interrumpir el proceso a las 20 minutos, agitando la fiola
Transcurridos los 20 minutos se diluyo de manera seriada la mezcla hasta obtener dos diluciones una 10-1 y otra 10-2.
De la mezcla sin diluir y de las dos diluciones, se sembraron porrastrilleo alícuotas de 0,05 ml y 0,1 ml en placas de medio A. Se tenian así 6 placas.
Se dejaron incubar a 37 °C por 48 horas.
b) Titulación de la cepa donante y receptora.
Se realizan las titulaciones de donante y receptora simultáneamente con la experiencia anterior.
Se realizan diluciones seriadas por separado de ambas cepas hasta alcanzar un factor de 105 para cada una. De esta dilución sesiembran por rastrilleo 0,05 ml y 0,1 ml para donante y para receptora en placas de agar LB. Se obtienen 4 nuevas placas.
Se dejaron incubar a 37 °C por 24 horas.
c) Control de reversión
Se realiza el procedimiento similar al realizado en a), pero se sustituyen las 0,5 ml de la cepa donante por 0,5 ml de LB.
Se deja reposar por 20 min también, y luego se siembra por rastilleo directamentesin diluir, 0,05 ml y 0,1 ml sobre placas de medio selectivo A.
Se dejaron incubar a 37 °C por 48 horas.
d) Control de fenotipos de las cepas donantes y receptoras.
Se tenían 5 placas: LB, LBS, EMB, A, y B; se divido en dos cada una y se marcaron en una sección con una D (donante) y en la otra con una R (receptora).
Se siembra por agotamiento las cepas donantes y receptoras en la sección...