bioquimica

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFÍA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR Y FARMACOLOGÍA
PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
2010

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Prof. Rocío Inga Peña

La concentración de proteínas en solución puede ser determinada tanto por espectrometría como por métodos colorimétricos. La determinación por espectrofotometría alongitud de onda de 280nm (luz ultravioleta) utilizando cubetas de cuarzo, es muy precisa.
Los diferentes métodos colorimétricos también permiten medir la concentración de proteínas en solución. La elección del método depende de la naturaleza de la proteína, de otros componentes presentes en la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad deseada.


OBJETIVO: Determinar la concentración deproteínas en muestras problema mediante los tres métodos colorimétricos más frecuentemente utilizados: Biuret, Lowry y Bradford,


Método Biuret

Compuestos que tienen dos o más uniones peptídicas (péptidos y proteínas) al reaccionar con el reactivo de Biuret (sulfato de cobre alcalino) se forma un complejo de color púrpura. Este color es el resultado de la coordinación de los átomos de nitrógeno delenlace peptídico con el Cu+2. La intensidad del color y la cantidad de producto depende de la concentración de proteínas. Este método es reproducible pero poco sensible. El rango de sensibilidad de este método es de 0,25 – 200 mg de proteínas por mL de solución, y el tiempo que toma realizar la prueba es de aprox 20-30 min.


Método de Lowry

Es un método más sensible que el de Biuret pudiendodetectar muy bajas concentraciones (hasta 5 ug). El principio de la detección es el mismo que el de Biuret con la diferencia en que se utiliza un segundo reactivo: la solución de Folin– Ciocalteau (fosfomolíbdato-fosfotungstato) en un medio cúprico alcalino, el cual se le agrega para incrementar la intensidad del color. Este incremento en la intensidad se debe a la reducción del reactivoFolin– Ciocalteau por los residuos de tirosina y triptofano presentes en las proteínas. El producto coloreado de la reacción es leída en un espectofotómetro a 750 nm.


Método de Bradford

Es un método basado en el uso del colorante Azul brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250), el cual se une a las proteínas en una solución ácida causando un cambio en la longitud de onda de absorciónmáxima del colorante, de 465nm a 595nm. Para la determinación de la concentración de proteínas se realiza la lectura a 595nm.
Este método presenta varias ventajas :
- Rapidez, ya que la reacción es bastante rápida (menos de 5 minutos) y el producto se mantiene estable hasta por 1 hora.
- Alta sensibilidad, ya que se puede detectar cantidad de proteínas de 1 a 20 ug.
- Pocas sustancias queinterfieren con la reacción: detergentes Tritón-X100 y Dodecil sulfato de sodio (SDS).
Su principal desventaja (al igual que Lowry) es la variación significativa entre diferentes proteínas.
El método de Bradford es el actualmente uno de los más utilizados en los laboratorios.



PROCEDIMIENTO:

Para cada uno de los métodos se preparará una curva estándar utilizando la solución Stock del Albúminasérica bovina (BSA) siguiendo los volúmenes determinados en cada una de las tablas.

NOTA: Las soluciones stock de BSA para el método de Biuret es de mayor concentración que la solución stock que se utilizará para los métodos de Lowry y Bradford.

A. Método de Biuret:
Concentración de BSA Stock = 28mg/ml.
1.- Preparar 9 tubos de ensayo según la tabla a continuación:
Reactivo
Blanco
Curva estándarM1


1
2
3
4
5
6

Agua (l)
100
90
80
60
40
20
0
50
Std 28mg/ml (l)
0
10
20
40
60
80
100
0
Muestra (l)
0
0
0
0
0
0
0
50

2- Agregar 1,5 ml del reactivo de Biuret y mezclar por agitación.
3- Incubar por 10 minutos a 37ºC.
4- Leer en el espectrofotómetro a 540 nm.
5- Anotar los resultados y graficar.

B. Método de Bradford:

Concentración de BSA Stock = 0.25 mg/ml.

1.- Preparar 8 tubos...