bioquímica experimental I

Cálculo del punto isoeléctrico de un péptido

La ionización de los grupos funcionales de los
aminoácidos depende del pH
Ecuación de Henderson-Hasselbach:
HA
Ka=

A- + H+

[A-] . [H+]
[HA]

pH = -log [H+]
pKa = - log Ka
Grupos ácidos (carga negativa): pH = pKa + log [A-]/[HA]
Grupos básicos (carga positiva): pH = pKa + log [B]/[HB+]

Ionización de aminoácidos y péptidos
Losaminoácidos libres presentan al menos dos grupos
ionizables, capaces de intercambiar H+ con el agua.
La presencia de más de un grupo ionizable hace que existan
formas anfóteras, capaces de comportarse como ácido y como
base.
H 2A

HA- + H+

A2- + 2H+

Punto isoeléctrico (pI) es el valor de pH al cual la forma
predominante de un compuesto dado presenta carga neta nula.
A valores de pHmayores que el pI, la molécula presenta carga
negativa.
A valores de pH menores que el pI, la molécula presenta carga
positiva.

Ionización de aminoácidos y péptidos
Nombre
Alanina
Arginina
Asparragina
Ácido aspártico
Cisteína
Glutamina
Ácido glutámico
Glicina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptófano
Tirosina
ValinapKa α-COO2,3
2,2
2,0
2,1
1,8
2,2
2,2
2,3
1,8
2,4
2,4
2,2
2,3
1,8
2,0
2,2
2,6
2,4
2,2
2,3

pKa α-NH3+
9,7
9,0
8,8
9,8
10,8
9,1
9,7
9,6
9,2
9,7
9,6
9,0
9,2
9,1
10,6
9,2
10,4
9,4
9,1
9,6

pKa R
------12,5
------3,9
8,3
------4,2
------6,0
------------10,0
------------------------------------10,1
-------

Cálculo de punto isoeléctrico
Únicamenteexisten tres posibilidades:
1) La forma neutra del péptido aparece justo al neutralizarse un
grupo.
pI = Semisuma de pKas de este grupo y del siguiente
(en sentido ascendente)

2) La forma neutra del péptido coincide con la neutralización de
parte de los grupos de un mismo tipo:
pI = Ecuación de Henderson-Hasselbach
3) La forma neutra del péptido coincide con la neutralización de
la mitadde los grupos de un mismo tipo:
pI = pKa de dicho grupo

Titulación de aminoácidos

-1


Curva de titulación de la glicina

pI =

pKaα-COOH + pKaα-NH3+
2

0


+1


pI =

2,5 + 9,5
2

= 6,0

=

Titulación de péptidos

pI =

pKaR-COOH + pKaα-NH3+
2

pI =

Moles de OH- añadidos por mol de péptido

Curva de titulación de un tetrapéptido

4,0 + 9,0
2= 6,5

=

Punto isoeléctrico de un péptido
Calcular el punto isoeléctrico del siguiente péptido:
H-His-Glu-Leu-Lys-Ile-Val-Gly-Trp-OH
pKa α-COOH = 2,1; pKa R-COOH = 4,0; pKa R-His = 6,5; pKa α-NH2 = 9,0; pKa R-NH2 = 10,5

Todo protonado:
+ His-Glu-Leu-Lys-Ile-Val-Gly-Trp
+

0

+

Carga neta
+3

0

Se desprotona el carboxilo terminal:
+ His-Glu-Leu-Lys-Ile-Val-Gly-Trp -+2

Se desprotona el R-COOH del Glu:
+ His-Glu-Leu-Lys-Ile-Val-Gly-Trp -

+1

+

+

0

+

-

+

Se desprotona el R-NH de la His:
His-Glu-Leu-Lys-Ile-Val-Gly-Trp +

-

0

+

pI =

pKaR-His + pKa α-NH2
2

=

6,5 + 9,0
2

= 7,75

Problema fuera de serie
Calcular el punto isoeléctrico del siguiente péptido:
H-Ala-His-Glu-Lys-Asp-Lys-Lys-Val-Leu-Trp-Ile-Lys-OHpKa α-COOH = 2,1; pKa R-COOH = 4,0; pKa R-His = 6,5; pKa α -NH2 = 9,0; pKa R-NH2 = 10,5

Sol: pI = 10

Problema fuera de serie
Una mezcla de proteínas (A, pI = 4,0; B, pI = 5,2; C: pI = 9,8; D,
pI = 7,3; E, pI = 6,4; F, pI = 8,0) en un tampón acetato pH 5,0
se aplicó a una columna cambiadora de cationes Dowex-50
equilibrada con el mismo tampón. ¿En qué orden eluirán las
seis proteínasal lavar la columna con un gradiente de fuerza
iónica creciente?
En las condiciones descritas la proteína A no sería retenida por
la columna, al estar cargada negativamente a pH 5,0 (pH > pI).
Para el resto, la afinidad por las cargas negativas de la
columna será mayor cuanto mayor sea su pI. Así, eluirán en
este orden:
1ª
2ª
3ª
4ª
5ª

B
E
D
F
C

Protocolo de purificación
Se...