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PRODUCCIÓN Y PRESERVACION DE CELULAS COMPETENTES Método Cloruro de Calcio B. Introducción La transformación fue el primer proceso de transferencia genética que se describió en los procariotas y elmismo demostró que el DNA es el material genético. La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchasbacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, queocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. Cuando serealiza en el laboratorio es indispensable que se células se encuentren competentes para aceptar el DNA. La competencia en las células se logra de varias formas, sin embargo, el uso de reactivos químicosque debiliten la pared y membrana celular es el método más utilizado. En este laboratorio vamos a tratar bacterias con cloruro de calcio C. Procedimiento Producción de células competentes 1. Inocular100µL de un cultivo de fresco de 10-15 horas en 20mL de Luria Broth. 2. Incubar a 37°C con movimiento durante 1-2 horas. Crecer las células hasta cuando la densidad óptica (OD 660nm) se encuentreentre 0.6 y 1. 3. Rápidamente coloque las células en hielo. 4. Centrifugar las células durante 5minutos, a 4 C y una velocidad de 2,000rpm. Descarte el sobrenadante y coloque rápidamente el tubo con lascélulas en hielo. 5. Suspender las células en 5mL 0.1M cloruro de calcio frío y estéril. 6. Mantenga el tubo con las células en hielo durante 40 minutos.

7. Centrifugar las células durante5minutos, a 4 C y una velocidad de 2,000rpm, luego descarte el sobrenadante y coloque rápidamente el tubo con las células en hielo. 8. Suspender las células en 1mL 0.1M cloruro de calcio frío y estéril. 9....