Biotecnología

PROCEDIMIENTO:
1 Crecimiento células en presencia de ampicilina y recolección.




2 Extracción del plásmido























1. PROCEDIMIENTO DE TRABAJO
Enmedio estéril
1- Con un asa de siembra tomar media colonia aislada de células portadoras del plásmido con inserto
2- Inocularla en el tubo con medio LB+ampicilina
3- Incubar a 37ºC 24H (hastadensidad óptica 109 células/ml)
4- Comprobar el crecimiento de la bacteria E.coli portadora de plásmido con inserto de ADN de pata de mosca, agitar el tubo con el vortex y comparar con el control negativo5- Aglomeración de las células por medio de centrifugación (aquí no hace falta hacerlo en medio estéril)
5.1 A partir del tubo de ensayos que contiene la bacteria, con una micropipeta se toma 1,5mly se lleva a un tubo eppendorf de 1,5ml
5.2 Centrifugar a 5000rpm durante 5min (se equilibran los tubos antes de centrifugar)
5.3 A temperatura ambiente, descartar el sobrenadante en un vaso deprecipitados con lejía, quedando el precipitado, pellet (células aglomeradas) en el fondo del tubo eppendorf
5.4 En el tubo eppendorf donde está el pellet repetimos el proceso desde el paso 5.1cinco veces hasta haber centrifugado los 5ml del cultivo de E.coli (siempre en el mismo tubo el fin es agrupar todas las células)
6- Después de cada una de las 5 centrifugaciones desechamos elsobrenadante en lejía
7- Resuspendemos el pellet en 100µL de la solución TE, esta solución esta compuesta por Tris es un tampón que mantiene las condiciones en un pH 8 y EDTA que hace el papel de quelante,reteniendo los metales que están libres en la célula y que podrían actuar como cofactores permitiendo que actuaran las nucleasas y atacaran a los ácidos nucléicos,
8- Agregamos 200 µL de la solución delisis, este reactivo ataca la membrana celular y provoca un cambio brusco de pH (NaOH, cambio brusco de pH y SDS desnaturaliza las proteínas de la membrana por lo cual la membrana se rompo y los...