biotecnologia cap 6

EL AUMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
Plásmido pCP3 (Fig. 6.6) fue creado en un esfuerzo por obtener el más alto posible nivel de producción-proteína extraña en una E. recombinante coli cepa.Esta plásmido contiene el promotor fuerte p L, el gen de β-lactamasa (ampicilina gen de resistencia) como un marcador seleccionable, una secuencia de clonación múltiple inmediatamente aguas abajo delpromotor, y un origen sensible a la temperatura de la replicación del ADN que aumenta el número de copias del plásmido de 5 a 10 veces cuando la temperatura de crecimiento se aumenta a 42 ° C (Fig. 6.7). Células de E. coli que llevan el plásmido pCP3 se cultivan primero a 28 ° C y entonces desplazado a 42 ° C. A la temperatura más baja, el represor c I, que es integrado en el huésped E. ADNcromosómico coli, es funcional, el promotor PL está apagado, y el número de copias del plásmido es normal (aproximadamente 60 copias por célula). A la temperatura más alta, el sensible a la temperatura c I represor es inactivado, el promotor p L está activo, y el plásmido de copia número aumenta a alrededor de 600 copias por célula. Estas propiedades hacen pCP3 un vector de expresión particularmente eficaz.Cuando el gen de la DNA ligasa T4 enzima se inserta en el sitio de clonación múltiple de pCP3, aproximadamente el 20% de la proteína celular producida a 42 ° C es la ADN ligasa T4. Esta nivel de expresión es mucho más alta que incluso para el más abundante nativa E. proteínas de E. coli, tales como el factor de elongación EF-Tu, que tienen una nivel de expresión de alrededor de 2%.

Sistemas agran escala
En recipientes de cultivo pequeños (de 1 a 5 litros), la inducción se logra fácilmente, ya sea por cambiando la temperatura o mediante la adición de un inductor químico. En planta piloto de tamaño.

FIGURA 6.6 Representación lineal de E. coli pCP3 vector de expresión con un con temperatura origen de replicación sensible a ADN (ori ts) que causa un aumento en el plásmido el número decopias a 42 ° C y un promotor p L controlado por un sensible a la temperatura proteína represora, un sitio de clonación múltiple (MCS), y una resistencia a la ampicilina Gen (Ampr).



FIGURA 6.7 E. células de E. coli que contienen un plásmido con un origen sensible a la temperatura de La replicación del ADN contiene un número limitado de copias deplásmido a 28 ° C, que es amplificada en gran medidacuando la temperatura se cambió a 42 ° C.



(20 a 200 litros) y de tamaño industrial (> 200 litros) biorreactores, sin embargo, un cambio de la temperatura requiere tiempo (30 a 60 minutos) y energía, ambos de los cuales puede ser costoso. Del mismo modo, el coste de un inductor químico, tales como IPTG, que es requerido para la expresión de un gen clonado en un biorreactor a gran escala puedehacer que el proceso global antieconómico. Para superar algunos de los problemas asociado con el uso del promotor p L para las fermentaciones a gran escala, una sistema de dos plásmido se ha desarrollado. El represor c que fue puesto bajo el control del promotor trp y se inserta en un número de copias bajo plásmido (Fig. 6.8). El uso de un plásmido de bajo número de copias asegura que c exceso de Irepresor moléculas no se producen.Un segundo plásmido lleva una clonado gen bajo el control del promotor P L.Como se muestra en la Fig. 6.8a, la promotor trp se activa en ausencia de triptófano, por lo que el represor c I proteína se sintetiza y el promotor P L está apagada.En contraste, como se muestra en la Fig. 6.8b, el promotor trp se apaga en presencia de triptófano, por lo que la proteínarepresora c no se sintetiza y el promotor P L es
Plenamente activo.

Con este sistema de dos plásmido, las células pueden cultivarse en un barato medio que consiste en melaza y hidrolizado de caseína, que contiene sólo muy pequeñas cantidades de triptófano libre, y luego inducida para expresar el gen clonado mediante la adición de triptona al medio. Triptona contiene triptófano libre suficiente...