Biotecnologia

Protocolo de preparación de células competentes frescas

Se recomienda este protocolo para la producción de células competentes de eficiencia bastante alta, para la clonación confiable de insertos individuales de ADN genómico digerido en experimentos de construcción de genotecas. Cuando es posible obtenerlas, también recomendamos el empleo de las células competentes disponibles en el comerciopara la construcción de genotecas. Estas células son excelentes para los experimentos de sublocación.

1. Cultive hasta el día siguiente la cepa deseada en 10 ml de medio LB (sin antibiótico), dos días antes del empleo previsto de las células.
2. Diluya 1.5 ml del cultivo obtenido al día siguiente en 40 ml de medio LB precalentado a37 ˚C.
3. Agite a 37 ˚C hasta que la DO600 llegue a 0.4-0.6(unas 2.5 a 3 h).
4. Transfiera las células a un tubo de 50 ml para centrifugadora (por ejemplo, marca Corning) y enfríe sobre hielo por 20 min.
5. Centrifugue la suspensión de células durante 15 min a 3000 rpm a 4 ˚C.
6. Elimine con cuidado la capa sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado pipeteando con suavidad 20 ml de 50 mM CaCl2 esterilizado y muy frío. Use la punta dela pipeta paravolver a suspender con suavidad las células.
7. Enfríe sobre hielo durante 20 min.
8. Centrifugue la suspensión de células durante 15 min a 3000 rpm a 4 ˚C.
9. Elimine con cuidado la capa sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado pipeteando con suavidad 4 ml de 100 mM CaCl2 esterilizado y muy frío. Use la punta dela pipeta para volver a suspender con suavidad las células.
10.Coloque sobre hielo y mantenga en el refrigerador hasta usarla la mañana siguiente.

S. chacoense transformada utilizando Agrobacterium. Las células transformadas comienzan a formar callos en los lados de las hojas

Protocolo para el desarrollo del PCR

* La reacción de PCR es llevada completamente in vitro y requiere para su desarrollo de los elementos siguientes: 2 oligonucleótidos sintéticos ocebadores (primers), que deben ser complementarios a la región de interés y generalmente únicos para el microrganismo de estudio, lo que proporciona la alta especificidad; una enzima termoestable, Taq polimerasa, proveniente de la bacteria Thermus aquaticus y 4 desoxyribonucleótidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

•Este procedimiento, permite obtener una duplicación exponencial de la secuencia deinterés por medio de 3 pasos fundamentales en un proceso cíclico; es decir, cada ciclo consta de un proceso de desnaturalización (95oC) que permite la apertura de las dobles cadenas; luego viene seguido por un proceso de anillamiento (40-65oC), que consiste en la unión o el apareamiento de los oligonucleótidos o cebadores que se encuentran en la mezcla de reacción con los extremos 3´ de la secuenciaespecífica del ADN, formando una unión ayudada por enlaces iónicos (primers y hebra de ADN); en donde la enzima Taq polimerasa se pueda unir y comenzar en presencia de los 4 nucleótidos trifosfatos con la tercera etapa que es la fase de síntesis (72oC), la cual se refiere al copiado del templado que se van uniendo por enlaces iónicos dando como resultado una nueva molécula del fragmento de ADN deinterés en este caso de Helicobacter pilory (hp) (Premoli et al., 2004)

Protocolo para el desarrollo de Electroforesis

Requerimiento de Recursos:
Muestra de ADN genómico, mitocondrial o producto de PCR (El volumen de la muestra depende del tamaño de los posos del gel de agarosa).

Materiales.

Guantes desechables.
Bata de laboratorio
Tijeras.
Tarro de desecho para puntas y geles.Papel parafilm
Pipeta 20 L
Puntas 100L.
Botellas de 1L
Erlenmeyer de 100 mL

Equipos:
Plancha magnética calentadora.
Cámara de electroforesis
Fuente de poder
Balanza electrónica
Soporte para el gel de agarosa con sus respectivas peinetas.
Trans-iluminador de luz ultravioleta
Cámara Polaroid
Careta protectora contra luz ultravioleta.


PREPARACION DE LA GEL DE AGAROSA

Pesar...