Biotecnologia

OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NÚCLEICOS

INTRODUCCIÓN:
La capacidad de extraer y purificar los ácidos nucleicos (DNA y RNA) a partir de una gran variedad de fuentes, es un requisito esencial en todas las técnicas de Biotecnología Molecular. Existen diferentes protocolos para el aislamiento de ácidos nucleicos, la mayoría de ellos tienen como objetivo la obtención de material de altapureza, apto para realizar cualquier procedimiento.

OBJETIVO:
Extraerá ácidos nucleicos, aplicando técnicas comerciales específicas para la obtención DNA genómico a partir de células bacterianas y de mamífero (bovino)

PROCEDIMIENTO:

1.- EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE COMPLETA CON EL ESTUCHE COMERCIAL Promega Wizard®.
1.- Colocar aproximadamente 300µL de sangre completa en un tubotipo eppendorf de 1.5 ml.
2.- Agregar solución Lisis I según se muestra en la Tabla 1

2.- Incubar las muestras en hielo durante 15 min, mezclando bien por inversión de manera suave. Centrifugar durante 10 min a 2000 rpm (5 min según consideración).

3.- Descartar sobrenadante y resuspender la pastilla de leucocitos obtenida en solución Lisis I, incubar 5 min en hielo y centrifugar como en lepaso anterior. Repetir la operación hasta obtener una pastilla limpia (blanca).

4.- Lisis del núcleo. Agregar solución de lisis de núcleo, mezclar por inversión o hasta disolver la pastilla y proseguir con vortex por 20 s.

5.- Precipitación de proteínas. Añadir la solución de precipitación de proteínas, y proceder al vortex por 20 s. Centrifugar*.
6.- Precipitación de ADN y rehidratación.Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo conteniendo Isopropanol (Volúmenes de la Tabla 1).

7.- Mezclar y centrifugar*. Descartar el sobrenadante, adicionar etanol al 70% (mismo volumen que el de Isopropanol) y centrifugar*. Aspirar el etanol y secar la pastilla por aire seco (De 10 a 15 min). Rehidratar la pastilla de ADN con el volumen apropiado de la solución de rehidratación de ADN poruna hora a 65 ºC o durante la noche a 4 ºC.
Tabla 1. Soluciones recomendadas para la utilización del Estuche de extracción de ADN genómico Promega Wizard®.

Tamaño de muestra Solución de Lisis Solución de precipitación de proteínas Isopropanol Solución de rehidratación de ADN
Celular Núcleo
20 µL 60 µL 20 µL 6.7 µL 20 µL 10 µL
50 µL 150 µL 50 µL 16.5 µL 50 µL 25 µL
300 µL 900 µL 300µL 100 µL 300 µL 100 µL
1ml 3 ml 1ml 330 µL 1 ml 150 µL
3ml 9 ml 1.5 ml 1 ml 3 ml 250 µL
10ml 30 ml 10 ml 3.3 ml 10 ml 800 µL

*Muestras de ≤ 300 µL, a 13,000 a 16,000 x g , por 20 s.
Muestras de 1 a 10 ml, a 2,000 x g2, por 10 min.

2.- Extracción de DNAg a partir de cultivos bacterianos (Cat # A1120, Promega).

1.- Centrifugar 500µL de cultivo bacteriano a 16,000/2 minutos. Descartarel sobrenadante.

2.- A la pastilla de células, agregar 300 µL de solución de lisis (nucleic lysis solution) y resuspender las células suavemente.

3.- incubar a 80ºC/5 minutos para lisar los nucleos. Enfriar a temperatura ambiente.

4.- Agregar 3 µL de solución de RNAsa, mezclar por inversión e incubar a 37ºC/15 minutos.

5.- Agregar 100 µL de solución de precipitación de proteínas ymezcle al vortex, por 20 segundos vigorosamente.

6.- Incubar la muestra en hielo por 5 minutos.

7.- Centrifugar a 14,000 rpm/ 3 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.

8.- agregar 300 µL de isopropanol y mezclar por inversión.

9.- Centrifugar a 14,000 rpm/ 2 minutos.

10.- Lavar la pastilla, secar y resuspender e 50 µL de solución de rehidratación.

ANÁLISIS YCUANTIFICACION DE MUESTRAS:

- Preparar un gel de agarosa al 1.5 % y depositar 5 l de la muestra de ADN genómico en cada carril del gel.
- En los tres primeros carriles se depositar un marcador de masa (Lambda 0.578g/l GIBCOBRL) en concentración de 50, 100 y 250 ng respectivamente.
-Una vez obtenidos los patrones electroforéticos, calcular la concentración de ADN de cada una de las muestras...