Biólogo

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSTGRADO

AVANCE DE TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
TÍTULO:

“PRODUCCIÓN Y AISLAMIENTO DE BETAGALACTOSIDASA DE Kluyveromyces sp”

AUTOR:

Ms.C. EMETERIO MARINO OLIVARES DE LA CRUZ
Doctorando de la Escuela de Postgrado de la Universidad Nacional de Trujillo ASESOR: Dr. STEBAN ILICH ZERPA

Código Nº: ...............TRUJILLO – PERÚ 2011

RESUMEN El objetivo de esta investigación fue la producción y el aislamiento de galactosidasa de Kluyveromyces sp cultivada en suero de leche desproteinizado. Para ello, primero se indujo la producción de -galactosidasa adaptando a la cepa de Kluyveromyces sp a la lactosa como la única fuente carbonada. El suero desproteinizado por termocoagulación fue analizadoquímicamente, obteniendo 94.5% de humedad, 0.30% de proteína, 4.80% de lactosa y un pH 4.6. La producción de -galactosidasa se realizó en un fermentador de 2 L de capacidad, el cual contuvo 1350 mL de medio de producción y 150 mL de inóculo, ambos preparados con suero desproteinizado suplementado con 0,15% de extracto de levadura y 0,1% de (NH4)2SO4, ajustado a pH 5 y esterilizado en autoclave por 10minutos a 120ºC. Ambos medios fueron incubados a 30ºC por 19 horas, con una agitación de aproximadamente 190 rpm y una aireación moderada. La extracción de la -galactosidasa se hizo primero separando las células por centrifugación a 6000 rpm por 10 minutos, y, finalmente, adicionando tolueno a razón del 2% (V/V) y centrifugando a 6000 rpm por 20 minutos para obtener el sobrenadante que contuvo a la-galactosidasa. La -galactosidasa fue aislada precipitándola con acetona fría a razón de 50% (V/V), y separándola por centrifugación a 6000 rpm por 30 minutos. Se determinó la concentración de proteínas según el método de Lowry et al y se ensayó la actividad de -galactosidasa usando O-nitrofenil-betaD-galactopiranósido (ONPG) como sustrato. Se observó que hubo mayor producción de -galactosidasa alcabo de varias generaciones de adaptación de la levadura a la lactosa, obteniéndose 6.5 U/mL de -galactosidasa cruda. Se logró aislar -galactosidasa con un rendimiento del 37.23% y 6.8 veces de -

purificación. Se concluye que es posible producir buena cantidad de

galactosidasa cultivando Kluyveromyces sp en suero de leche desproteinizado.

INTRODUCCION La producción de enzimas se refierea los procesos agrupados en varias etapas, siendo las básicas la generación o “producción” celular de la enzima, la recuperación o aislamiento de la enzima (incluye la separación sólido-liquido o clarificación, extracción y concentración) y la purificación en sí de la enzima1. La producción de enzimas depende del origen o fuente de la enzima y del fin de su uso o aplicación1. En general, todos losseres vivos son fuentes naturales de enzimas; por ello, primero se debe encontrar una fuente apropiada de la enzima de interés1, luego, y paralelamente, se debe seleccionar y utilizar los métodos y técnicas más adecuados para obtener enzima de calidad, con un buen rendimiento y con el menor costo posible de producción1,2,3. Una vez “producida”, la enzima es aislada del organismo productor. Lasoperaciones de recuperación nos permiten obtener un extracto enzimático “crudo” capaz de ser purificado1,2,3. Tal etapa, a diferencia de la primera, no depende del origen de la enzima, pero si de su localización extracelular o intracelular1,4. La extracción de una enzima intracelular involucra la disrupción o permeabilización de las membranas celulares. Para ello, existen diversos métodos; tal es elcaso del uso de solventes orgánicos como el tolueno. Una vez obtenido el extracto crudo se procede generalmente a liberarlo de impurezas y purificarlo1,4. La -galactosidasa está bastante distribuida en la naturaleza5, se encuentra en plantas8, animales y microorganismos6,7,8. Kluyveromyces sp.9,10 (K. lactis3,11,12,13,14,15, K. fragilis7,16, K. marxianus17,18) destaca como buen productor GRAS...