bomba de protones en levadura

Transporte de glucosa y bombeo de protones
en Saccharomyces cerevisiae

INTRODUCCIÓN
La molécula de glucosa representa la principal fuente de carbono y energía para la mayoría de las células. El ingreso del azúcar a la célula, que marca el inicio del catabolismo, es un proceso altamente regulado que varía de una célula a otra, dependiendo de sus funciones. En Saccharomyces cerevisiae, unalevadura que requiere del aporte constante de glucosa para procesarla por las vías aeróbica o anaeróbica, la captación de azúcares es un proceso complejo en el que participan numerosos transportadores pertenecientes a una familia multigénica, compuesta por al menos 20 genes diferentes (Bisson y Coons, 1993; Conde et al., 2010). Los mecanismos y la cinética de este transporte han sido motivo dediscusión durante años, sin embargo, hasta el momento, únicamente se sabe que se trata de una captación multifásica compleja, pero se desconoce el número y tipo preciso de sistemas de transporte participantes (Conde et al., 2010).
Además de ser una excelente fuente de carbono para S. cerevisiae, la glucosa actúa como señal para la regulación génica de diversos procesos celulares (Bisson y Coons,1993). Una molécula cuyo gen es inducido por la presencia de este azúcar es la ATPasa de protones (H+-ATPasa, EC 3.6.3.6) (García-Arranz et al., 1994). Esta enzima se localiza en la membrana plasmática de S. cerevisiae, en donde participa bombeando protones del citoplasma al exterior para regular el pH intracelular que disminuye durante el crecimiento celular (Fig. 1). A la par de que expulsaprotones, esta ATPasa genera un gradiente electroquímico necesario para el ingreso de nutrientes a la célula, entre los que se incluye a la propia glucosa. A nivel postraduccional, la glucosa también afecta a la H+-ATPasa, promoviendo una modificación covalente en la proteína que incrementa su actividad transportadora (Malpartida y Serrano, 1981). La acidez citoplásmica y la presencia de azúcares en elexterior de la célula también suscitan esta activación, pero por mecanismos cinéticos diferentes (Gancedo, 2008 y Pereira et al., 2008).




Figura 1. Relación entre el transporte y metabolismo de la glucosa, y la actividad de la H+-ATPasa en S. cerevisiae (Pardo y Martínez, 2009).

OBJETIVOS
Determinar por un método colorimétrico el transporte de glucosa en S. cerevisiae.
Establecer larelación existente entre el consumo de glucosa y la actividad de la H+-ATPasa membranal.
Observar el efecto de un inhibidor de la síntesis de ATP mitocondrial sobre la actividad de la H+-ATPasa membranal.

Material

Reactivos
2 vasos de precipitados de 30 mL
Potenciómetro y amortiguadores de referencia para calibrar
1 parrilla con agitador magnético
1 cronómetro
Micropipetas de 200 y 1000L
Puntas para micropipeta
Piceta con agua destilada
30 tubos de ensayo de vidrio
16 tubos Eppendorf de 1.5 mL
1 microcentrífuga
1 pocillo
1 parrilla
1 espectrofotómetro
guantes de látex

Suspensión celular de Saccharomyces cerevisiae en agua (2g/10 mL)
Solución de glucosa al 10%
Solución de azida de sodio (NaN3) 500 mM
Solución stock de glucosa a una concentración de 100 µg/mLReactivo de cobre
Reactivo de arsenomolibdato


Preparación de las células (a cargo de los técnicos académicos).

1. Disuelva dos gramos de levadura granulada en 10 ml de agua destilada y deje reposar durante 15 min a temperatura ambiente.
2. Centrifugue la suspensión a 3000 rpm durante 3 min (en una centrífuga clínica) y resuspenda el precipitado en 10 ml de agua (repita dos veces estepaso).
3. Resuspenda el último precipitado en 5 ml de agua.

MÉTODO

A) Actividad de la H+-ATPasa (Pardo y Martínez, 2009)
Control
1. Diluya 2.5 mL de la suspensión de levadura con 20 mL de agua destilada.

2. Mantenga la suspensión en agitación constante ayudándose de una parrilla con agitador magnético, mida el pH con el potenciómetro previamente calibrado. Repita la operación en dos...