Bradfordlowry

Fundamento del método de Lowry: Utiliza un reactivo capaz de formar un complejo coloreado con las proteínas contenidas en la muestra, con la intensidad del color siendo proporcional a la concentración de las proteínas contenidas en la muestra. Esto se lleva a cabo en 2 etapas, ambas en un medio básico. En la primer etapa, se genera la reacción de Biuret, donde los iones de cobre Cu2+ forman uncomplejo con los átomos de nitrógeno en los enlaces peptídicos de las proteínas, por lo tanto generando un desdoblamiento en la proteína, exponiendo los anillos fenólicos de los aminoácidos para llevar a cabo la segunda reacción, con el reactivo de Folin-Ciocalteau (de color amarillo por la presencia del acidofosfomolibdotúngstico), el cual se reduce utilizando al cobre como un catalizador alreaccionar con los grupos fenólicos de las proteínas, generando un complejo de color azul intenso.
Fundamento del método de Bradford: En esta reacción, se utiliza el colorante azul brillante de Coomassie G-250 para que, en condiciones ácidas, forme un complejo colorido, debido a que el colorante dona sus electrones libres a los grupos ionizables de las proteínas, lo cual genera una disrupción en laproteína generando uniones entre las proteínas y el colorante por medio de uniones de van der Waals, además de la unión que tienen por interacciones iónicas, estabilizando la forma azul del colorante, por lo que la cantidad del complejo entre la proteína y el colorante presente en la solución es una manera de medir la concentración de proteínas al medir su absorbancia.
Objetivos:
Elaborar una curvade calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico
Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.
Conocer el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo del color.
Analizará las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otros métodos para la cuantificaciónde proteínas.
Resultados
Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina (método de Lowry)
Tubo No.
Cantidad de proteína (µg)
A590


Serie a
Serie b
1
25
0.035
0.029
2
50
0.054
0.068
3
75
0.111
0.113
4
100
0.102
0.121
5
125
0.120
0.145
Figura 1. Curva de calibración de la hemoglobina por el método de Lowry
Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico (método de Lowry)
Tubo No.
A590
Cantidad deproteína (µg)
1
0.086
71.7
2
0.102
87.7
3
0.121
106.7
4
0.089
74.7
5
0.088
73.7
6
0.078
63.7
7
0.085
70.7
8
0.081
66.7
9
0.082
67.7
10
0.090
75.7

Tabla 3. Resultados del análisis estadístico (método de Lowry)
X (Media)
S
S2
%CV
µ
%Error
75.9
12.64
159.95
16.66%
84.94, 66.86
1.2%

Tabla 4. Efectos de algunas sustancias no proteicas en el método de Lowry.
Tubo No.
Sustancia
A590
Cantidad de proteína(µg)
Tipo de interferencia
1
Fenol al 1%
1.401
1386.7
+
2
Mercaptoetanol 0.1%
0.132
117.7
+
3
Tris 1M, pH 10.0
0.101
86.7
+
4
Urea al 5%
0.147
132.7
+
5
(NH4)2SO4 al 3%
0.145
130.7
+
Tabla 5. Curva de calibración de la hemoglobina (método de Bradford)
Tubo No.
Cantidad de proteína (µg)
A595


Serie a
Serie b
1
25
0.285
0.264
2
50
0.376
0.451
3
75
0.490
0.465
4
100
0.491
0.535
5
125
0.651
0.616Figura 2. Curva de calibración de la hemoglobina por el método Bradford
Tabla 6. Réplicas para el análisis estadístico (método de Bradford)
Tubo No.
A595
Cantidad de proteína (µg)
1
0.558
103.27
2
0.495
84.18
3
0.596
114.79
4
0.428
63.88
5
0.312
28.72
6
0.438
66.90
7
0.615
120.55
8
0.577
109.03
9
0.642
128.72
10
0.602
116.60

Tabla 7. Resultados del análisis estadístico (método de Bradford)
X (Media)S
S2
%CV
µ
%Error
93.66
31.90
1018.17
34.06%
116.47, 70.85
24.88%
Tabla 8. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el método de Bradford
Tubo No.
Sustancia
A595
Cantidad de proteína (µg)
Tipo de interferencia
1
Fenol al 1%
0.569
106.60
+
2
Mercaptoetanol 0.1%
0.552
101.45
+
3
Tris 1M, pH 10.0
0.607
118.12
+
4
Urea al 5%
0.565
105.39
+
5
(NH4)2SO4 al 3%
0.620
122.06
+...