¿Cómo aislar leucocitos en sangre periférica?

Manual de procedimientos de laboratorio

Separación de leucocitos (PBMC) para posterior extracción de RNA utilizando el buffer de lisis ACK.

1. Recolección de sangre
1.1. Tubos EDTA (morados)4ml. (x 3)*
2. Centrifugación
2.1. 3500 RPM durante 5 minutos
2.2. Observar el pellet blanquecino, en caso contrario repetir paso 2. **
3. Obtención de leucocitos
3.1. Retirar el sobrenadanteutilizando pipeta de 1ml cuidando no retirar el pellet blanquecino.
3.2. Retirar el pellet con pipeta de 1ml y colocar en tubo de Ependorf. ***
3.3. Repetir el mismo procedimiento para cada uno delos tres tubos EDTA.
4. Separación con buffer ACK
4.1. Colocar 500 microlitros de buffer ACK para obtener una concentración (leucocitos/ACK) aproximadamente de 1:1
4.2. Resuspender suavemente,moviendo el tubo durante 30-60 segundos.
4.3. Centrifugar los tubos Ependorf (20 C / 3500 RPM / 5 minutos)
4.4. Revisar la formación de pellet blanquecino en el fondo del tubo
4.5. Retirar elsobrenadante con pipeta 1ml
4.6. Repetir todo el paso 4 nuevamente reduciendo la cantidad de buffer ACK en 100 microlitros por vez hasta limpiar el pellet. ****
5. Conservación
5.1. Agregar 100microlitros de solución salina estéril al pellet blanquecino final y conservar en refrigerador de -70º C


Recomendaciones finales.
*Es preferible utilizar tubos EDTA sobre aquellos heparinizados paraeste procedimiento.
**Vigilar por defectos en la toma de muestra, hemolisis; si no ha ocurrido recomendamos repetir la centrifugación.
***Recomendamos guardar el sobrenadante en tubo seco en caso dequerer realizar otras mediciones.
**** Usualmente se requieren entre 3 y 5 lavados para obtener el resultado deseado.




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Manual de procedimientos de laboratorio

Separación deleucocitos (PBMC) para posterior extracción de RNA utilizando el buffer de lisis ACK.

1. Recolección de sangre
1.1. Tubos EDTA (morados) 4ml. (x 3)*
2. Centrifugación
2.1. 3500 RPM durante 5...