Cadena en reaccion de la polimerasa

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
1. INTRODUCCIÓN
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica in Vitro que imita la habilidad natural de la célula para duplicar el ADN, generando múltiples copias de una secuencia específica de nucleótidos o amplificando selectiva y exponencialmente el ADN de un organismo. Por lo tanto, es un procedimiento muy sensible que en teoría,permite detectar específicamente una sola molécula del ADN en solución, lo que ha generado el desarrollo de muchos métodos de diagnóstico basados en este principio.
Una de las ventajas que plantea esta técnica es la adaptación del método general para determinar la presencia de una secuencia específica en cualquier agente patógeno, incluyendo bacterias, protozoarios, virus y helmintos, ya que, todoslos organismos invasores poseen ADN o ARN, como material genético. De esta manera, puede proveer resultados en el mismo día para organismos en los que normalmente se tomarían varias semanas utilizando tecnologías convencionales.
El diseño continuo de protocolos que incluyen diferentes secuencias iniciadoras, cebadores o primers, y múltiples variaciones en la concentración de cada uno de loscomponentes de la PCR según la secuencia de nucleótidos que se desee amplifica, se debe a que el ADN o ARN usado como blanco cambia entre especies, y por ende los sistemas de medición son modificados y adaptados a nuevas tecnologías que mejoren la sensibilidad, especificidad y rapidez en la determinación. Es así como, en la actualidad ya están disponibles kit de diagnóstico de PCR en tiempo real.
2.OBJETIVOS
• Comprender las fases de desnaturralización, hibridización y elongación o extensión que comprende la PCR.
• Analizar cada uno de los componentes necesarios para la realización de una amplificación de ADN.
• Realizar la amplificación de un fragmento de ADN.
• Discutir algunas aplicaciones de la amplificación de los fragmentos de ADN por
PCR.
FUNDAMENTO
La Reacción en Cadenade la Polimerasa (PCR), es una técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. A través de ciclos; donde en cada uno se duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento y en unas pocas horas.
Esta metodología fue ideada porel bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en una de las primeras compañías dedicadas a la comercialización de la Ingeniería Genética la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En 1993 Mullis obtuvo elPremio Nobel de Química por este trabajo.
Dentro de las principales aplicaciones de la PCR se encuentran: Estudios Arqueológicos, Medicina Forense, Genética, Pruebas de paternidad, Investigaciones Biomédicas, Ambientales, Industriales y Diagnóstico Clínico. En este último, los Laboratoristas Clínicos, pueden tomar una muestra mínima de material genético, copiar la secuencia de interés las vecesnecesarias y generar suficiente cantidad de muestra para detectar la presencia o ausencia de patógenos y en muchos casos realizar la cuantificación del mismo.
PROCESO METODOLOGICO
Cada ciclo de PCR consta de tres fases:
1. Desnaturalización: En esta el ADN blanco de doble cadena se somete a una temperatura de 90º a 95 ºC durante 30 segundos; permitiendo la separación de las dos cadenas.
2.Hibridización: En esta la temperatura de la mezcla se disminuye hasta alcanzar la temperatura adecuada para favorecer el apareamiento de los primers con la secuencia blanco, lo cual generalmente ocurre entre 45 a 55 ºC (dependiendo de la temperatura de Fusión o Tm de los primers) durante 20 a 30 segundos
3. Elongación o extensión: En este la temperatura de la mezcla se eleva hasta 72 °C para...