Campylobacter

Campylobacter
La detección cuantitativa

Los pollos sacrificados en los tres días de muestreo tenían una media de peso de 2250 g. El peso medio de los cadáveres de la muestra fue 1743 g, las pechugas con hueso y piel tuvieron 607 g de peso medio, los pares de filetes de pechuga tenían un peso medio de 417 g.
Para la cuantificación de Camyplobacter, cadaveres, pechugas y filetes de pechuga seagitaron rigurosamente a mano durante 90 s en bolsas de plástico después de la adición de 500 ml de NaCl 0,9% / peptona-agua. Diluciones decimales en 0,9% de NaCl / peptona-agua fueron preparados a partir de 1 ml de agua de enjuague y 1 ml de agua hirviendo. Cien microlitros de cada dilución se extendieron por duplicado en placas de CCDA y Karmali. Las placas se incubaron a 42 º C durante 48 h enuna atmósfera microaerofílica.
Como una variación de las recomendaciones de ISO 10272-1,2:2002 colonias presuntivas se recultivadas en medios selectivos hasta que monocultivos fueron obtenidos, seguido por un crecimiento en Mueller-Hinton-agar (Oxoid) con la adición de 5% de sangre de oveja (Oxoid ) en lugar de Columbia-sangre-agar. La confirmación de presuntas colonias fue realizada mediantepruebas de motilidad con el microscopio de contraste de fases, la tinción de Gram, reacciones de oxidasa y catalasa. Se llevó acabo la Identificación por medio de pruebas bioquímicas.

Tipificación molecular de Campylobacter spp. por PFGE

Preparación de ADN que contienen bloques de agarosa de PFGE se ha adaptado a''CAMPYNET'' prototipo estándar del protocolo para la PFGE. Las células fueroncultivadas durante 24 h en Mueller-Hinton-agar con 5% de sangre de oveja a 37 ° C bajo condiciones microaeróbicas y se suspendió en buffer Pett IV a una densidad óptica McFarland 6-7 . 500 microlitros se mezclaron con 500 ll 2% inCert-agarosa. La mezcla fue puesta en moldes y se solidificó por 20-30 min a 4 ° C. Tapones se incubaron en 3.0 ml de solución de lisis ESP a 56 ° C durante al menos 24 h.Los tapones se lavaron cuatro veces durante 30 minutos cada vez, en 20 ml de buffer TE. El ADN fue cortada durante 18 horas a 25 ° C con SmaI y a 37 ° C con KpnI en 100 ll de buffer de restricción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Digeridos los tapones de ADN fueron cargados en 1% SeaKem gel de agarosa grado tecnología genética y separados en a contour-clamped homogenous electricfield DR-II apparatus , en 0,5 buffer-TBE por 22.5 ó 23 h (SmaI y KpnI), respectivamente, a 10 ° C.
Condiciones de electroforesis fueron de 6 V / cm, el ángulo incluido de 120 grados, y los tiempos de rampa para fragmentos de SmaI son 0.5-40 s, y de fragmentos KpnI 4.20 s. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron en una solución de bromuro de etidio 0.0003% durante 7 minutos, desteñidoen agua destilada durante 30 minutos, las bandas se visualizaron con luz UV, fotografiado con una cámara digital y se guardan como archivos TIFF para su uso con BioNumerics 4.0. La normalización se realizó de acuerdo a la cepa CNET 068 como se recomienda en el CAMPYNET prototipo estándar del protocolo de PFGE en cada gel, con un estándar utilizado por cada cuatro muestras. Un estándar de pesomolecular se utilizó como control de la electroforesis, también. La Construcción de matrices de similitud se llevó a cabo con BioNumerics 4,0 software y se utilizó el coeficiente de banda basado Dice. El método (UPGMA) se utilizó para los patrones de racimo. Bandas para el análisis con el coeficiente de Dice fueron asignados de forma manual, de acuerdo con las curvas de densitometría y la fotografíaque acompaña la copia impresa . Todos los perfiles de macrorrestricción (PLM) fueron evaluados y asignados a grupos de perfil arbitrariamente definidas''''(PG´s) mediante el uso de un cut off de el 90%.

Resultados

Los resultados del examen cualitativo (Tabla 1) muestran que de 99 muestras analizadas 51 (51,5%) fueron positivas para Campylobacter. Estos se distribuyeron de la siguiente...