Capitulo6

6. METODOS

6.1 Extracción de la antocianina

La extracción de antocianina es comúnmente realizada por una repetida
maceración o molido con pequeñas cantidades de HCl (0.1%-1.0%) en metanol o etanol a
temperatura ambiente o en casos complejos en frío usando ácidos débiles (para evitar la
degradación del pigmento). La adición de agua (10%-15%) en algunos casos permite una
extracción completadependiendo de la planta (Strack y Wray, 1989). La extracción del
pigmento de rábano se realizó modificando la metodología descrita por Guisti y Wrolstad
(1996) mostrada en la Fig. 6.

6.2 Purificación de la antocianina

La purificación es un paso muy importante, debido a que en la extracción se
arrastran contaminantes los cuales pueden afectar la estabilidad o el análisis del
pigmento. En lapurificación de antocianinas se usa una fase sólida para la extracción
(PVPP y C18), que permite remover un gran cantidad de compuestos interferentes
(azúcares, ácidos). Para la purificación se uso los siguientes materiales:
Metanol acidificado 0.01%
Agua acidificada 0.01%
Polivinil poli pirrolidona (PVPP)
Cartucho C18 (Sep-Pak Cartidge, 360 mg)
Embudo de vacío
Papel Whatman # 1
Bombas al vacío
MatrazErlenmeyer para vacío
Pipetas
* La succión al vacío se hace para agilizar el paso de los solventes a través del papel filtro
En las Figs. 7 y 8 se muestra el procedimiento.

Lavado del rábano

Pelado de rábano, utilizando un pelador o cuchillo

La cáscara se sumerge en metanol acidificado al
0.01% (v/v)
Dejar 1 día en el refrigerador
Filtrar el metanol en el papel filtro Whatman No. 1

Evaporar elmetanol en un rota vapor a 39º C

Obtención de la antocianina concentrada

Figura 6. Extracción de la antocianina de la cutícula de rábano.

Primer paso

Poner en el embudo el papel filtro Whatman #1 y encima el PVPP en polvo
(0.5 cm de espesor)

Empapar el PVPP con agua acidificada (revolver), succión al vacío

Empapar el PVPP con alcohol acidificado (revolver), succión al vacío

Empapar el PVPPcon agua acidificada, poner 15-30 mL de pigmento
(revolver), succión al vacío (un matraz)

Repetir varias veces
Empapar el PVPP con alcohol acidificado, succión al vacío (un
matraz)
Reunir 150 mL de alcohol acidificado con el pigmento

Utilizar rotavapor Buchi a 39º C
Obtención de antocianina purificada

Figura 7. Primer paso de purificación utilizando polivinil poli pirrolidona (PVPP).

Segundopaso:
Acondicionar el Cartucho C18

5 mL de agua acidificada, succión al vacío

5 mL de alcohol acidificado, succión al vacío

5 mL de agua acidificada, succión al vacío
(matraz)

5 mL de pigmento, succión al vacío

Repetir varias veces

5 mL de alcohol acidificado, succión al vacío
(matraz)

Reunir 150 mL de alcohol acidificado con el
pigmento

Utilizar rotavapor Buchi a 39º C

Obtención deantocianina purificada.
Almacenar a 4º C hasta las pruebas

Figura 8. Segundo paso de purificación de la antocianina usando el cartucho C18

6.3 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION

Para la obtención de la concentración de la antocianina se utiliza el método de pH
diferencial. La antocianina experimenta una transformación reversible con los cambios de
pH manifestado por un llamativo cambio en laabsorbancia. La forma oxonium
predomina a pH 1 y el hemiacetal a pH 4.5. El pH diferencial es un método basado en
esta reacción, y permite una rápida y exacta medida de la antocianina total, incluso en la
presencia de pigmentos degradados polimerizados y de otros compuestos interferentes.
Este método fue utilizado primero por Fuleki y Francis (1968) para medir el contenido
de antocianina en arándano.Materiales
Buffer pH1 (0.025 M Cloruro de Potasio)
Buffer pH4.5 (0.4 M Acetato de Sodio)
Celdas de cuarzo para UV- Visible
Agua destilada
Espectrómetro de UV-Visible
Pigmento
Pipeta
El método se describe en la Figura 9.
Para la obtención de la concentración de antocianina se utiliza la fórmula de pH
diferencial:
A= (Aλ vis-max – A λ700)pH1 – (Aλ vis-max – Aλ 700)pH 4.5
En donde A

vis-max

es la...