Caracterización fosfataza ácida (procedimiento)

|
| |PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE
| |FACULTAD DE QUÍMICA
||



CURSO
LABORATORIO BIOQUIMICA










EXPERIENCIA 3

“Caracterización Fosfatasa Acida”




















Cris-GreeD





Objetivo General:

- Caracterizar lacinética enzimática de la fosfatasa acida

Objetivos Específicos:

- Determinar el efecto del pH en la reacción enzimática de la fosfatasa acida
- Determinar el efecto de la temperatura en la reacción enzimática de la fosfatasa acida
- Estudiar el efecto de la concentración del sustrato en la reacción enzimática de la fosfatasa acida
- Determinar el efecto de un inhibidor en lacinética de la reacción de la fosfatasa acida
Fundamentos:

- La fosfatasa acida, al ser una enzima, presenta una temperatura y un pH en la cual su actividad enzimática es óptima, lo cual nos otorga parámetros específicos de medición de la actividad de esta enzima a diferentes rangos tanto de temperatura como de pH, lo cual nos sirve como base para poder diseñar un plan de aislación de estaenzima y posteriormente someter distintas muestras a distintos rangos de las variantes antes mencionadas.

- El método de cuantificación de esta enzima corresponderá al método de muestras sometidas a absorbancia en un espectrofotómetro, el resultado, será comparado con la muestra patrón y finalmente utilizando la ecuación de Lambert-BeerA= ε x l x C

Materiales y métodos:

- Columna de filtración
- Gel de sephadex G-75 ( o inferiores )
- Pipeta
- Bureta
- Vaso de precipitado de 100 ml
- Vaso de precipitado de 50 ml x 2
- Centrifuga
- Mechero ( trípode + rejilla)
- Bagueta
- Etanol ( 25% y 50% de concentración)
- Levadura o Germen de trigo

Procedimiento:- Se cultiva a una temperatura aproximada de 27°C nuestra muestra de levadura o germen de trigo, por un tiempo aproximado de 3-21 horas (se puede dejar en cultivo en la mañana previa a la realización del practico, para de esta manera poder poseer una muy buena muestra principal. (Enriquecimiento de Fosfatasa)
- La muestra enriquecida con fosfatasa es aislada por agitación durante dosminutos con esferas de vidrio (granos de cristal), de no contar con ellas, se puede centrifugar, manteniéndose la temperatura no inferior a 18°C (Centrifugación controlada a 15.000 rpm)
- Posteriormente se elimina la fase sólida de la centrifugación, colectándose en baño de hielo controlando a -15°C el sobrenadante
- Se concentra el sobrenadante con una concentración de etanol al 50%.- Se filtra el concentrado con una columna (incorporando gel de sephadex G-75 o inferiores)
- Se agrega un concentrado de metanol al 25% a la columna para favorecer la separación, siendo la primera fracción separada la que contiene toda la actividad de la fosfatasa.

Efecto del pH en la actividad enzimática de la fosfatasa acida


- Para poder determinar el efecto del pH en lafosfatasa acida, se debe preparar, en primera instancia, las disoluciones buffer a distintos pH y así poder realizar una medición exacta del pH óptimo de actividad. Para esta práctica se realizaran ensayos con buffer citrato a PH 2.0; 3.8; 5.0; 6.5; 8.0. Estos valores son debido a que como se trata de la fosfatasa acida, se sabe que su trabajo optimo está a un pH acido, por lo que, cualquier...