Caracterizacion cinetica de la beta glucosidasa de almendra dulce

Caracterización cinética del mecanismo catalítico de la β- glucosidasa de almendra
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I. Introducción……………………………………………………………………………………………………………….2
* Objetivos experimentales…………………………………………………………………………………….2
II. Materiales y métodos………………………………………………………………………………………………..3
* Materiales…………………………………………………………………………………………………………..3
*Métodos……………………………………………………………………………………………………………..3
* Valoración de la actividad enzimática…………………………………………………….3
* Determinación de los parámetros cinéticos de la β-glucosidasa…………….4
* Determinación del pH óptimo…………………………………………………………………5
* Determinación de la temperatura optima………………………………………………5
* Cinéticas con sustratos alternativos……………………………………………………….6
* Cinéticas de inhibición…………………………………………………………………………….6
* Modificaciónquímica…………………………………………………………………………….7
III. Resultados………………………………………………………………………………………………………………….7
IV. Discusión…………………………………………………………………………………………………………………..14
V. Conclusión…………………………………………………………………………………………………………………18
VI. Bibliografía………………………………………………………………………………………………………………..19

Marta Achaques Rodríguez (taquilla 15)

I. Introducción
Las β-Glucosidasas son un grupo heterogéneoy bien caracterizado dentro de las enzimas glucosidasas. Estas enzimas, catalizan la reacción de hidrólisis de enlaces O-β-Glicosídicos del extremo terminal no reductor de de oligosacáridos de cadena corta, disacáridos y
Aril- o alquil-β-D-glucósidos, liberando β-D-glucosa.
Las β-glucosidasas están extensamente distribuidas en la naturaleza. Dependiendo del organismo del que proceden y de laespecificidad de sustrato de la enzima, las β-glucosidasas están implicadas en diferentes funciones fisiológicas [1,2]. En bacterias y hongos, las β-glucosidasas se encuentran fundamentalmente formando parte de complejos o sistemas multienzimáticos denominados celulasas, los cuales se encargan de la degradación de la celulosa, polímero lineal de β-D-glucosa muy abundante en la biomasa. Esta enzimacataliza la etapa limitante de este proceso
Además de su importancia fisiológica, la β-glucosidasa presenta interés como un versátil catalizador industrial. En la conversión de la biomasa (degradación de la lignocelulosa a glucosa), la β-glucosidasa es indispensable para que el sistema multienzimático celulasa sea eficaz, ya que no solo cataliza la última etapa del proceso de degradación, sino queevita la inhibición por producto de las dos enzimas que actúan previamente (la celobiohidrolasa y la endoglucanasa).

Los sustratos naturales de estas enzimas son múltiples, dependiendo del organismo en el que se encuentren. Así, atendiendo a la especificidad de sustrato que muestren, las β-Glucosidasas pueden agruparse en tres grupos fundamentalmente:
a) aril-β-glucosidasas;
b)celobiasas
c) β-glucosidasas de especificidad amplia
En nuestro caso, la enzima a estudiar es la β-Glucosidasa de la almendra dulce (Prunus dulcis).
La β-Glucosidasa de almendra es, con probabilidad, la más utilizada en estudios cinéticos de las glucosidasas debido a que es fácil aislarla, la fuente es muy accesible, es comercial y sus ensayos utilizando como sustratos aril glucósidos son bastantefáciles de realizar. Sin embargo existen varias isoformas de esta enzima lo que dificulta en parte la interpretación de los resultados cinéticos.

Objetivos experimentales
En general, lo que se pretende es la caracterización del mecanismo catalítico de esta enzima y proponer un modelo para este. Para ello habrá que:
* Estandarizar las condiciones de ensayo de la β-glucosidasa:
*Determinar los parámetros cinéticos macroscópicos de la ß-glucosidasa de almendra para el sustrato p-nitrofenil-ß-D-glucósido (pNPG).
* Estudiar el efecto del pH en los parámetros cinéticos de la ß-glucosidasa para el p-nitrofenil-ß-D-glucósido.
* Estudiar el efecto de la temperatura en los parámetros cinéticos de la ß-glucosidasa para...