Caracterizacion de fosfatasa acida

OBJETIVOS:
1. Determinar el efecto del pH en la reacción enzimática de la fosfatasa acida.
2. Determinar el efecto de la Temperatura en la reacción enzimática de la fosfatasa acida.
3. Estudiar el efecto de la concentración del sustrato en la reacción enzimática de la fosfatasa acida.
4. Determinar el efecto de un inhibidor en la cinética de la reacción de la fosfatasa acida.Resultados:

1.- Efecto del pH en la reacción enzimática:

Tubo | pH | Velocidad (M/min) | Absorbancia (nm) |
1 | 3,5 | 8,22E-08 | 0,604 |
2 | 4,8 | 1,30E-07 | 0,959 |
3 | 5,6 | 1,20E-07 | 0,883 |
4 | 6,4 | 1,06E-07 | 0,777 |
5 | 7,2 | 9,37E-08 | 0,689 |
Tabla N°1

Gráfico N°1: Velocidad de reacción v/s pH

2.- Efecto de la temperatura en la reacción enzimática:

Tubo |Temperatura (°C) | velocidad M/min | Absorbancia (nm) |
1 | 0 | 4,93E-08 | 0,363 |
2 | 25 | 8,56E-08 | 0,629 |
3 | 37 | 7,41E-08 | 0,545 |
4 | 50 | 6,53E-08 | 0,48 |
5 | 70 | 4,67E-08 | 0,343 |
Tabla N°2

Gráfico N°2: Velocidad de reacción v/s Temperatura

3.- Efecto de la concentración del sustrato en la reacción enzimática, en ausencia de un inhibidor:
tubo | [Sustrato] (M) |velocidad (M/min) | Absorbancia (nm) |
B | 0 | 0 | 0 |
1 | 2,42E-06 | 6,91E-08 | 0,508 |
2 | 4,68E-06 | 1,34E-07 | 0,982 |
3 | 7,09E-06 | 2,02E-07 | 1,488 |
4 | 9,52E-06 | 2,72E-07 | 2 |
Tabla N°3
Tubo | 1/[sustrato] | 1/velocidad |
B | 0 | 0 |
1 | 413223,14 | 14471780 |
2 | 213675,21 | 7462686,57 |
3 | 141043,72 | 4950495,05 |
4 | 105042,02 | 3676470,59 |
Tabla N°4: Doblesrecíprocos
4.- Efecto de un inhibidor en la cinética de la reacción:
tubo | [Sustrato] (M) | Velocidad (M/min) | Absorbancia (nm) |
B | 0 | 0 | 0 |
1 | 2,37E-06 | 6,57E-08 | 0,497 |
2 | 4,40E-06 | 1,26E-07 | 0,925 |
3 | 7,50E-06 | 2,14E-07 | 1,575 |
4 | 8,54E-06 | 2,77E-07 | 1,793 |
Tabla N°5
Tubo | 1/sustrato | 1/velocidad |
B | 0 | 0 |
1 | 421940,93 | 15220700,2 |
2 |227272,73 | 7936507,94 |
3 | 133333,33 | 4672897,19 |
4 | 117096,02 | 4098360,66 |
Tabla N°6: Dobles recíprocos

Gráfico N°3

Gráfico N°4

| Km | Vmax |
Enzima sin inhibidor | 0,032 | 9,01E-04 |
Enzima con inhibidor | 1,6E-04 | 4,38E-06 |
Tabla N°7: Valores experimentales de Km y Vmax

Discusión

La velocidad de una reacción enzimática puede verse afectada por diversosfactores, en ésta oportunidad, se estudiaron experimentalmente los siguientes:
* Efecto del pH.
* Efecto de la temperatura.
* Efecto de la concentración.
* Efecto de un inhibidor.
Efecto del pH en la reacción enzimática: El pH no afecta la actividad enzimática directamente, sino, que modifica la concentración de protones. Los protones además de alterar la estructura de la enzima y essustrato, pueden también participar en la reacción como sustrato o como producto, en éstos casos la concentración de protones afecta directamente la velocidad de la reacción.
Las enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos –COOH, Amino –NH2, tiol –SH, imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, éstos grupos pueden tener carga eléctrica positiva,negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica, éste es el llamado pH óptimo.

La fosfatasa ácida es más activa a pH 5 (pH óptimo para ésta enzima), lo cual coincide con los resultados obtenidos experimentalmente que se pueden observar en el gráfico N°1.La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad.
Como ligeros cambios de pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular, éstos sistemas son los llamados...