Caracterización parcial de un extracto de ananá

Caracterización de la actividad proteolítica de un extracto de Ananá
Laura Magallanes,Mariana Oroño, Florencia Pessolano.

INTRODUCCIÓN El origen del ananá ( Ananas comosus) es de algún lugar incierto de las zonas tropicales de América del Sur. Pertenece a la familia de las Bromeliáceas. Es una planta vivaz constituida por una base de hojas enteras, de hasta 60cm de largo, las hojas sonplanas y dobladas hacia el suelo y con bordes espinosos. De la base sale un tallo florífero portador de varias flores en disposición helicoidal. Fruto en bayas, casi totalmente soldadas entre sí, formando una infrutescencia típica de la piña o ananá. Las proteasasas son una familia de enzimas que se caracterizan por hidrolizar esteres y enlaces amida, por tanto hidrolizan enlaces peptídicos endiferentes residuos aminoacídicos. Se clasifican en endo y exopeptidadas según el sitio de corte y según el orden de los residuos catalíticos de la cadena peptídica y las secuencias que los flanquean en, serinproteasas, cisteínproteasas, treonínproteasas, aspartilproteasas, glutamilproteasas y metaloproteasas. En el ananá se han encontrado dos cisteínproteasas distintas, la bromelaina y ananaina ( Rowanet al., 1988). La sobreexpresión de cisteínproteasas en algunos frutos tropicales, entre ellos el ananá es aun incierto, se cree que pueden proteger a la planta de patógenos, especialmente hongos e insectos. Muchas de estas proteasas son utilizadas en diversos procesos industriales, como por ejemplo en la industria alimentaria en la tiernización de carnes, producción de cerveza, en panificación ytambién en la producción de hidrolizados proteicos; en la producción de cueros e industria textil y en la industria farmacéutica como componentes terapéuticos (1). En este trabajo se realiza una caracterización parcial de un extracto de Ananas comosus (Bromeliaceae).

TRABAJO EXPERIMENTAL Materiales Azocaseína 1%; buffer fosfato 0.2M pH 7.5; buffer acetato 1M pH 5; buffer fosfato de sodio 1M pH6; buffer fosfato de sodio 1M pH 7; buffer Gly-NaOH 1M pH 10; buffer acetato 1M pH 5 con CaCl2 40mM; Iodoacetoamida 100mM; ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0.5M; floururo de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 200mM, β-mercaptoetanol 14.3M; ácido ascórbico 0.5M; ácido cítrico 0.5M; ácido tricloroacético (TCA) 10 y 12.5%; lactosuero de mozzarella; solución de leche descremada al 20%; reactivos de LowryMariana Oroño, Florencia Pessolano, Laura Magallanes

Equipos Espectrofotómetro Shimadzu UV-1603; centrifuga Sigma Nr. 12154-H; centrifuga Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed; pHimetro E520 Metrohm Herisau. Material vegetal Se utilizó un molino de cuchillas para obtener el extracto de ananá a partir del mesocarpo (434,45 g), luego se centrifugó durante 20 minutos a 5000 rpm y 4°C y seobtuvo el pellet y 200 ml del extracto crudo el cual fue filtrado por gasa. El mismo procedimiento se realizó para obtener un extracto de mamao. Método de coagulación de la leche En un tubo de ensayo se colocan 3 ml de una solución de leche descremada al 20 % y 2ml de buffer acetato 1M pH 5 con CaCl2 40 mM, se termostatiza en baño de agua a 30°C durante 10 minutos. Luego se le agrega 1 ml delextracto. Se mide el tiempo en que demora en coagular la solución de leche. La unidad de enzima se define como la cantidad de enzima suficiente para coagular la leche en 60 segundos en las condiciones del ensayo. Ensayo de actividad En un eppendorf colocar 0.34 ml de buffer fosfato 0.2M pH 7.5 y 0.34 de una solución de azocaseína al 1%, termostatizar en baño de agua a 37°C durante 5 minutos. Luegoagregar 0,34 ml de extracto y deja reaccionar por 10 minutos. La reacción se corta con TCA al 10% y se lo deja actuar 10 minutos. Luego se centrifuga por 15 minutos a 13000 rpm. Se mide la absorbancia del sobrenadante a 337 nm contra un blanco (2). El blanco se realiza intercambiando el orden de agregado de la enzima y el TCA. La unidad de enzima se define como la cantidad necesaria para aumentar una...