Celula

Procedimiento Normalizado de Trabajo

Cultivos celulares

ELABORADO:

REVISADO :

APROBADO:

Susana Hernández García

1

INDICE

1. OBJETO. 2. ALCANCE. 3. REFERENCIAS. 4. NORMAS DE SEGURIDAD. 5. MATERIAL Y EQUIPOS. 6. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA. 7. PROCEDIMIENTO.

2

1. OBJETO Describir el procedimiento para la realización de cultivos celulares. El cultivo celular se realizaen medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o faseen que crecen las células, las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio, la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura.

2. ALCANCE Este método es aplicable para la realización de cultivos en líneas celulares de células de mieloma múltiple tales como:

Línea celular MM1S MM1R MM144 U266 U66LR7 U266Dox4NCIH929 RPMI8266 RPMI LR5 OPM-2 MGG SJR

Tipo celular Mieloma Múltiple Sensible a dexametasona Mieloma Múltiple Resistente a dexametasona Mieloma Múltiple Mieloma Múltiple Mieloma Múltiple Resistente a Melfalán Mieloma Múltiple Sensible a Doxorubicina Mieloma Múltiple Mieloma Múltiple Mieloma Múltiple Mieloma Múltiple Delección en PTEN Mieloma Múltiple Mieloma Múltiple

Especie Humano HumanoHumano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano

3

3. REFERENCIAS Carvajal-Vergara X,tabera S,Montero JC,et al. Multifunctional role of Erk 5 in Multiple Myeloma. Blood 2005; 105: 4492-9

4. NORMAS DE SEGURIDAD Llevar a cabo todas las manipulaciones celulares bajo condiciones de esterilidad. Para asegurar la esterilidad de los procesos, usar guantes y, trabajar en campanaextractora de flujo laminar mientras se estén manipulando los cultivos. Eliminar todos los residuos como material biocontaminante. Cuando se estén descongelando las células o se proceda a su congelación tener en cuenta la toxicidad del DMSO, trabajar en cabina de seguridad biológica.

5. RECURSOS HUMANOS Debe ser realizado por el personal cualificado para su uso. 6. MATERIAL, EQUIPOS YREACTIVOS 6.1. Material • • • • • • • • Micropipetas de rangos adecuados. Pipetas de vidrio de rangos adecuados. Falkon. Viales de células. Placas de Petri para cultivo celular o si se prefiere flask (frascos de Roux). Scraper (rascador). Como material vivo líneas celulares tumorales. Hielo seco para congelar.

4

6.2. Equipos • • • Incubadora a 37ºC , 5%CO2, 95% de aire y a 1 atm de presión.Centrífuga. Congeladores y neveras: - Neveras a 4ºC para el almacenamiento de medios, PBS, ... - Congeladores de -20ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,...). - Congeladores de -80ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias especialmente sensibles(factores de crecimiento, mitógenos, inductores,...).
-

Unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-180ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares.

• •

Baño maría a 37ºC Microscopio invertido

6.3. Reactivos • Medio de cultivo RPMI 1640 (Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión) con 1% Glutamina, 1% Estreptomicina/Penicilinay 10% Suero bovino fetal (FBS). Si en vez de cultivar líneas celulares tratamos con células plasmáticas de pacientes tener en cuenta las mismas concentraciones excepto un 20% de Suero Bovino Fetal. Tener en cuenta que la glutamina es inestable en el medio, y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100×) que se mantiene congelado, no más de 1 semana antes de añadir el medio al...