celulas madre

Validación
Internacional
de nuestros
trabajos de
investigación.
11° REUNIÓN ANUAL DE LA
SOCIEDAD INTERNACIONAL

DE INVESTIGACIÓN
EN CÉLULAS MADRE

TRABAJO 1: COMPARACIÓN DE VIABILIDAD DEL CULTIVO DE CÉLULAS MADRE OBTENIDAS DE TEJIDO
ADIPOSO (ADAs) PRE Y POST CONGELACIÓN.
Avila-Portillo LM 1,3. Franco D1. Ávila JP2, Riveros A1, SabogalM2,3.
1. Stem Medicina Regenerativa. 2. SABAMEC,3. Hospital Militar Central.

Introducción
Las Células Madre obtenidas de tejido adiposo (ADAs) han sido consideradas una alternativa viable en Medicina
Regenerativa, al ser utilizadas en ensayos in vitro y clínicos como alternativa terapéutica en enfermedades crónico
degenerativas. Es por esto que cobra importancia el desarrollar tecnología para preservación de estas de forma segura.
Por loanterior, este estudio tiene como objetivo comparar viabilidad, crecimiento en cultivo, fenotipo y diferenciación a
linaje osteogénico de ADAs pre y post congelamiento con dos soluciones crioprotectoras.

Metodología
Previa firma del consentimiento informado se obtuvieron 12 muestras de tejido adiposo de individuos sanos sometidos
a liposucción. Mediante digestión enzimática con Colagenasa I0.075% (Gibco) se obtuvo fracción estromal vascular.
Figura 1
El congelamiento se realizo utilizando curva automatizada (Thermo Cryomed Freezer) y dos soluciones de
congelamiento DMSO/DEXTRAN/HSA (A) y DMSO/HESSICO/HSA (B). La viabilidad se comprobo mediante recuento en
cámara de Neubauer y azul de tripan. Las muestras fueron criopreservadas durante 3 meses a -196°C. El
descongelamiento serealizo utilizando la solución de PBS/HESSICO/HSA.
Para los cultivos celulares se emple[o DMEM-LG+LPRP10% a 37°C y 5%CO2. La fenotipificación se realizó en el citómetro
de flujo DB FACS Canto II utilizando los marcadores CD45, CD34, CD105, CD90 y CD74 y se empleó el kit de Stem Cell
Tecnologies para la diferenciación ósea.

Resultados

Adipose
tissue
Enzymatic
Digestion
Fraction
1Fraction
2

Cryopreservation

Culture

DMSO/Dextra
n/HSA

Cryopreservation

DMSO/HES
SICO/HSA

Dmso/de
xtran/hsa

Thawing
PBS/HSA/HESSICO

Dmso/he
ssico/hsa

Phenotyping
Bone
Differentiation

Thawing
PBS/HSA/HESSICO

Culture

Culture

Phenotyping
Bone Differentiation

Phernotyping
Bone
Differentation

La edad promedio fue de 35 años, de los cuales el 75%corresponde a
mujeres y 25% hombres. Se obtuvo un promedio 6.93x10´5 cel/g de grasa.
La fracción 2 cultivada previo al congelamiento (5.0x10´3 CMN/cm2) alcanzó
una confluencia del 90% el día 10 de cultivo y un X 14x10´6 células en el
primer pase. Tabla 1. Figura 2.
Ambas fracciones alcanzarton confluencia del 90% en X25 días de cultivo. La
fracción 2 crio preservada con la solución A presentópromedio de 6 días,
mientras que con la solución B se alcanzó un X de 9 días. (Fig. 3).

Figura 1. Metodología Utilizada

Discusión
Este
estudio
sugiere
que
la
solución
crioprotectora
DMSO/DEXTRÁN/Albúmina sería una mejor opción para criopreservación de
ADAS y que previo cultivo al congelamiento aumenta el porcentaje de
viabilidad de estas. Las 2 fracciones de ADAS conservanfenotipo y capacidad
de diferenciación a linaje osteogénico posterior al descongelamiento
Figure 2. Comparación de viabilidad de
células crio preservadas con dos
soluciones de congelamiento.
PARAMETRO

PROMEDIO
FRACCION 1
FRACCION 2
6x105 células
5,23x105 células

Células Nucleadas
solución A
Viabilidad solución A
34%
Células Nucleadas
5,22x105 Células
solución B
Viabilidad solución B25%

62%
6x105 células
35%

Tabla 1. Características de las fracciones
post descongelamiento.

Fig 3. Cultivo de ADAS. A) Un día en
medio de cultivo (20X). B) Células
después de 6 días de cultivo (10X). C)
Células después de 10 días de cultivo
(10X).

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