Celulas Madre

TÉCNICAS DE CLONACIÓN CELULAR

FES ZARAGOZA * UNAM
INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA
* CASILLAS SILVA ROSA CAROLINA*GONZÁLEZ CARPIO ROQUE AYARI *MATA MARTÍNEZ DANIEL*OLIVARES MORÍN RODRIGO M.*OLIVERA HUGO
10/11/2011
CAROLINA CASILLAS
MÉTODOS: TÉCNICAS DE MICROMANIPULACIÓN PARA LA CLONACIÓN



Métodos de clonación
Para la clonación existen técnicas específicas que estánadaptadas a los distintos tipos de organismos. Los objetivos de la mayoría de los experimentos de transferencia nuclear varían ampliamente, pero en la mayoría de los casos los procedimientos de micromanipulación se mantienen constantes y no son más que una herramienta que se utiliza para lograr estos objetivos.
Procedimientos de micromanipulación
Para escoger el medio de cultivo con que se tendráque realizar la micromanipulación depende primariamente de las especies de oocitos y los parámetros experimentales. De forma general la manipulación del medio es de hidroxietilpiperazina de ácido sulfúnico (HEPES)-buffer versiones de buffer de bicarbonato para medio de cultivo embriológico, con un pH balanceado para la acción de incubación. Algunos investigadores utilizan M2 que es un medioestandarizado, originalmente desarrollado para embriones de ratón, o también se encuentra el medio TL-HEPES que es para el medio de embriones de bovino; también se encuentran la SOF (fluído sintético del oviducto) y medio de lavado (FHM) entre otros.
La preparación de cámaras de micromanipulación
Éste método consiste en varias gotas con medio de manipulación cubierto con aceite de parafina paraprevenir la evaporación y la infección del mismo. El sistema de goteo resulta conveniente para la administración de grupos de oocitos a comparación del plato abierto lleno del medio. El sistema de múltiples gotas permite un medio con diferente composición con una tinción fluorescente, inhibidores del microfilamento, etc. que llegan a estar presentes en la misma cámara, lo cual alivia la necesidadde cambiar las cámaras para distintas operaciones. El material utlizado en esta construcción depende de la forma de Nomarski DIC (de vidrio) o el Sistema de Modulación de Contraste Óptico de Hoffman (de plástico). En el caso de Normarski DIC el portaobjetos de vidrio le es puesta silicona en forma de anillo para prevenir la indeseada expansión de las microgotas; en Sistema de Hoffan se utilizacomúnmente tapa de la caja de petri ya que facilita los ángulos de manipulación. De forma preferente se necesita que una de las gotas contengan medio con un 10% de PVP (polivinilpirrolidona) para el prelavado de la enucleación y la transferencia celular con pipetas.

TRANSFERENCIA NUCLEAR PIZOELÉCTRICA ASISTIDA
El pionero en ésta técnica es Wakayama, que uso modificaciones de la técnicaoriginal desarrollada por inyección intracitoplasmática de espermas. Utilizada para la clonación de ratones tiene un principio que puede ser aplicado a varias especies. La inyección directa nuclear ofrece una ventaja al minimizar la transferencia citoplásmatica (o del citoplasma) proveniente de las células somáticas donadoras y eliminar la necesidad de fusión. De cualquier forma esta técnicatiene mayor demanda y el procedimiento requiere una habilidad adicional y práctica para dominarla. El material pizoeléctrico es hecho de una cerámica especial la cual tiene una propiedad electromecánica especial que es expuesta sobre un campo eléctrico que induce la distorsión direccional del material. Cuando este material es abordado por la micropipeta de titulación el movimiento debe ser precisoen dirección a la punta de la pipeta. De forma sucesiva se hacen repeticiones para que la pipeta de punta pueda atravesar la zona pelúcida.
Un pulso de amplitud inferior solo se utiliza para romper suavemente el citoplasma de la membrana citoplasmática del oocito, permitiendo la transferencia de los núcleos de las células somáticas. Para este procedimiento existen ya dos dispositivos...