Centrifuacion Diferencial

Centrifugación Diferencial

Utilizada en fraccionamiento celular y subcelular. Se basa en la diferencia de velocidad de sedimentación de partículas biológicas de diferente tamaño, forma y densidad. Esta diferencia debe ser grande para poder ser observada al centrifugar: Las partículas que posean densidades similares sedimentaran juntas. Este método es inespecífico, por lo que se utiliza comocentrifugación preparativa para separar partículas de otros componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de núcleos y membrana) pero no es útil para separar moléculas. Se somete un homogeneizado a centrifugaciones repetidas aumentando cada vez la fuerza centrífuga.
Se logra así obtener las siguientes fracciones:
Núcleos, Mitocondrias, Lisosomas, Microsomas, Fracción solubleAplicaciones:
Eliminación de células procariotas en caldos de cultivo. Una manera bastante empleada en Bioquímica para obtener enzimas es el cultivo de bacterias en medios líquidos. Independientemente de que el enzima sea intra o extracelular, el primer problema con el que nos encontramos es la presencia de bacterias en el medio. La centrifugación del cultivo a 10.000 x g durante 20 minutos sueleser suficiente como para crear la fuerza centrífuga necesaria para sedimentar las células. Si el enzima es extracelular se descarta la pastilla bacteriana y se trabaja con el sobrenadante. Si se trata de un enzima intracelular habrá que resuspender las células en un volumen adecuado, lisarlas y volverlas a centrifugar, buscando la actividad enzimática en el sobrenadante (que se corresponderá conel material citoplasmático) o en el sedimento (membranas celulares).
 Precipitación de proteínas con sulfato amónico. La precipitación salina es una técnica muy empleada en purificación enzimática; presenta un alto rendimiento pero muy poca selectividad, por lo que suele ser utilizada en las etapas iniciales del proceso. Las proteínas son polielectrolitos de superficie, por lo que al añadir almedio una sal, los iones de ésta neutralizan las cargas de las proteínas, llegándose a una situación en la que, por no presentar carga neta, las proteínas floculan. Para que la técnica tenga éxito es necesario recurrir a la centrifugación diferencial: el protocolo conlleva una centrifugación a 10.000 x g durante unos 60 minutos para que las proteínas que están floculando en el medio precipiten. Tratamiento térmico. Algunas proteínas son mas termoestables que otras; si éste es el caso, un buen método para purificarlas es el tratamiento térmico. Las proteínas desnaturalizadas tienden a agregarse; una centrifugación diferencial ayudará a eliminarlas por sedimentación.

Centrifugación en gradiente de densidad.
   
Permite separar partículas de similar tamaño pero distinta densidad. Puedeusarse sedimentación de velocidad o de equilibrio. En el primer caso se utiliza un gradiente de
sacarosa (separación de componentes en preparaciones de membrana).
En el segundo, cloruro de cesio (purificación de DNA).
Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrífuga. Consiste en la separación de las partículas en función de su densidad de flotación. La muestra se dispone porencima o se mezcla con un gradiente de densidad más pronunciado que el del caso anterior, y que contiene una concentración muy elevada de sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Comoconsecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas  al fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Este método también se conoce como equilibrio en gradiente de densidad.  
Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como son sacarosa, percol, cloruro de cesio, etc. Los gradientes pueden ser autogenerados...