Centrifugación

Introducción


La estequiometria de absorción permite determinar la concentración de proteínas, ácidos nucleicos, y otras moléculas biológicas de muestra, gracias a la propiedad de absorber la radiación electromagnética. Para este practico, utilizaremos el método de Bradford.

El principio utilizado en el método de Bradford cuantifica la unión de un colorante hidrofóbico cuyasdisoluciones acuosas en presencia de ac. Fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina
un color azul intenso que se puede medir fácilmente, para hacerlo se compara primero una proteína estándar (generalmente albumina de suero bobino BSA) con el colorante para hacer una curva de calibración o curva estándar, con soluciones de BSAa las cuales se le mide la absorbancia en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 595 nm.

Teniendo la curva estándar se intrapola el valor de concentración en el grafico de absorbancia vs concentración de proteínas.



























Objetivos

- Extraer albúminas de diferentes legumbres.

- Aplicar el método de Bradford paradeterminar la concentración de proteínas de una muestra biológica















































































Procedimiento experimental

Materiales:

- Solución de proteína (albúmina de suero de bovino, BSA) de 1 mg/ml y 0.1 mg/ml.


- Reactivo de Bradford (azul deCoomasie).

- Semillas de haba y poroto.

- Morteros.

- Tubos de eppendorf.




- Solución de extracción (sulfato de potasio 5%, pH 7).


- Espectrofotómetro.




- Centrífuga.

























Procedimiento:

I. EXTRACCIÓN DE ALBÚMINAS DE SEMILLAS


- Colocamos 2 habas en el primer recipiente y 4 porotos en elsegundo, los llevamos a un mortero y se procede a moler hasta obtener una pasta homogénea. Mantener en hielo para inhibir la acción de las enzimas.


- Colocamos 0.1 gr de cada especie en tubos de eppendorf y luego agregamos 1 ml de solución de extracción (sulfato de potasio 5%, pH 7)

- Homogenizamos durante 1 minuto las soluciones en la agitadora vortex, luego las dejamos reposar enhielo durante otros 3 minutos. Repetimos esta operación dos veces más.


- Llevamos estos tubos a centrifugar a 10 rpm por 10 minutos a 4ºC.


- Luego de pasado este tiempo separamos el sobrenadante del pellet ya que esta parte contiene la fracción de albúminas.


- Pipeteamos 600 µL del sobrenadante para traspasar a otro eppendorf.


- Agregamos 50 µL de cadasobrenadante a un tubo de ensayo y se procedimos a diluir la fracción de albúminas obtenida en 2450 µL de buffers de extracción.

II. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA FRACCIÓN DE ALBÚMINAS


- La solución de BSA ya estaba preparada, tenía concentración conocida de 1 mg/ml y 0.1 mg/ml.


- Colocamos en una gradilla 9 tubos de ensayos y rotulamos.

- Preparamosen los tubos de ensayo 9 soluciones de 2000 µL en un rango de 0 – 30 µg/ml a partir de la solución de BSA y agua destilada.

- Pipeteamos 800 µL de cada solución en un correspondiente receptáculo (cada muestra por separado)

- Agregamos a cada receptáculo 200 µL y lo tapamos con cinta plástica y mezclamos inmediatamente para homogenizar (color verde azulado).

- Esperamos unosminutos y lo llevamos al espectrofotómetro a 595nm para que los leyera


Resultados
Según los resultados que nos arrojó el espectrofotómetro fabricamos un gráfico concentración de proteína vs absorbancia y con esto intrapolamos el valor de la concentración de la muestra problema.

Tablas:
1. Curva estándar

|Tubo |Concentración |Volumen |Volumen en µL...