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Colorimetríay espectrofotometría





COLORIMETRIA

Muchos de los experimentos bioquímicos incluyen la medición de un compuesto o un grupo de compuestos que hacen parte de una mezcla. Quizás la técnica más usada para determinar la concentración de dichos compuestos es la colorimetría. El fundamento de la técnica consiste en que si se pasa luz blanca a través de unasolución coloreada, algunas longitudes de onda se ab­ sorben con preferencia sobre las otras (figura 4.1).Muchos compuestos no son coloreados, pero pueden absorber lÚz en la región visible si se someten a la acción de un reactivo apropiado. Estas reacciones son a menudo específicas y muy sensibles, hasta el punto de poder medir cantidades de material en con­ centraciones de milimol porlitro. La mayor ventaja consiste en que no es necesario el aislamiento del compuesto y que se pueden determinar los cons­ tituyentes de una mezcla compleja tal como sangre, sin que se requiera mucho tratamiento previo. Tal como se discute a continuación, la intensidad del color es proporcional a la concentración del compuesto que se mide, mien­ tras que la cantidad de luz absorbidaes proporcional a la intensidad del color y por lo tanto a la concentración.


Ley de Beer-Lambert

Cuando se pasa un rayo de luz monocromática de intensidad inicial I 0 a través de una solución en un recipiente transparente, parte de la luz es absorbida de manera que la intensidad de la luz transmitida I es menor que 10. Ocurre alguna disminución en la intensidad de la luz pordispersión de las partículas o reflexión en las interfases, pero principalmente por absorción de la solución (figura 4.2). La relación entre I e 10 depende de la longitud del medio


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Colorlmetrle y e1pectrofotometrie '95
Luz incidente
(blanca)
Luz absorbida por
la solución coloreada
(roja)
Luz emergente y por consiguiente color de la solución (verde)


Rojo -~
Amarillo ---~-
- - •- - Amarillo

J Verd~
Azul ·-------•---- ----•------ Azul


Figura 4.1 Por qué son coloreadas las soluciones

absorbente, l, y de la concentración de la soluciónabsorbente, c. Estosfactores se hallan relacionados en la Ley de Lambert y Beer (figura 4.2}.

Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de unmedio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta.


)
Ley de Beer. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente aumenta.

Ley de Seer:

Estas dos leyes se combinan en la ley de Beer-Lambert:





Soluciónabsorbente, concentración e




Luz monocromática
Rayo incidente Rayo emergente
­­­­~
Intensidad l 0



Espesor de la ~oluCión ­e­/­
'
Intensidad l

Figura 4.2 Absorción de la luz por una solución
96 Bloqulmlceprjctlce

El cociente de las intensidades se conoce como la transmitancia y se expresa como un porcentaje:

T=I!Io=e-k,cl.

Sacando logaritmos:




o


log, 1011 = k3 el,

logj ¿ 1011= 2.303 k3cl,

log¡ 0 1011 = kcl.

La expresión log1010/ I se conoce como la extinción E, o absorbancia. La extinción se designa algunas veces como densidad óptica, pero este nombre no se recomienda actualmente. Por lo tanto,

E= kcl.

Si se sigue la Ley de Beer­Lambert y l se mantiene constante, un gráfico de la extinciónen función de la concentración da una línea recta que pasa por el origen; en tanto que un gráfico del porcentaje de transmitancia en función de la concentración da una curva negativa exponencial (figura 4.3).
Algunos colorímetros y espectrofotómetros tienen dos escalas, una lineal
de porcentaje de transmitancia y otra logarítmica de extinción. Esta última
escala es la que está linealmente...