ciclo del carbono

OBJETIVOS
-Determinar la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa en base a diferentes fuentes de carbono (glucosaa y succinato).
-Verificar si las diferentes condiciones de cultivo interfieren en la actividad de esta enzima.
- Observar el efecto que tienen los diferentes inhibidores sobre la cadena respiratoria.
-Obtener el porcentaje de transmitacia en base a la actividad de laenzima succinato deshidrogenasa.
-Observar el efecto que tienen los diferentes aceptores artificiales de electrones sobre la cadena respiratoria.
-Con base a los resultados obtenidos determinar cual es papel fisiológico de la succinato deshidrogenasa en Escherichia coli.
Hipótesis
Si la enzima succinato deshidrogenasa (SDH) en Escherichiacoli es inducible por succinato y reprimible en presenciade glucosa, entonces la actividad enzimática de la misma se verá afectada de tal manera que al adicionar succinato al medio la actividad reductora de este por acción de la enzima aumentará, mientras que en presencia de glucosa la actividad disminuirá ya que no se sintetizará más enzima y solo trabajará la que se encuentre en niveles basales.

FUNDAMENTO EXPERIMENTAL
a) Efecto de la fuente decarbono en el crecimiento de Escherichiacoli.
Para llevar a cabo esta determinación se realizó el cultivo de la cepa en dos matraces que contenían el medio de Sypher y Stratus uno adicionado con glucosa y el otro con succinato (cultivo inicial), a las 12h de incubación a 37°C se cosecharon y se separaron las células de ambos matraces a dos nuevos matraces para cada cultivo inicial que conteníancomo fuente de carbono glucosa y succinato, se midió la absorbancia a 600 nm de las alícuotas de cada uno de los cuatro matraces (Absinicial), se incubó 5h a 37°C y se volvió a medir la absorbancia de cada matraz (Absfinal)

b) Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinato deshidrogenasa.
El método de Ells es un método desarrollado para el ensayo de la succinato deshidrogenasay la deshidrogenasa láctica, basado en la observación de que el metasulfato de fenazina puede transferir un par de electrones entre los nucleótidos de pirimidina reducidos y el 2,6-Diclorofenol indiofenol. Este es el primer método espectrofotométrico desarrollado para ser aplicado en el ensayo de succinil deshidrogenasa soluble. La oxidación del succinato catalizada por Succinato deshidrogenasa,genera electrones que reducen al compuesto metosulfato de fenazina (PMS), que posteriormente reducirá al 2,6 diclorofenolindofenol (DCIP). La adición de metasulfato de fenazina a un sistema que contiene succinato, diclorofenolindofenol y succinil deshidrogenasa soluble, causa una rápida reducción del colorante indofenol, en el cual la tasa de reducción es proporcional a la cantidad de enzimaagregada.


Cianuro De Potasio. (KCN)
La función del cianuro de potasio en el desarrollo experimental, consistió en bloquear la enzima terminal de la cadena respiratoria, asegurando la transferencia de electrones hacia el metasulfato de fenazina reduciéndolo.
Efecto de la fuente de Carbono.
Para poder observar el efecto de la fuente de carbono en la actividad enzimática de la Succinatodeshidrogenasa fue necesario inducir en E. coli la formación de una cadena respiratoria artificial donde el aceptor de electrones es el 2,6 diclorofenolindofenol el cual sustituye al cit α,α3, ya que este se encuentra inhibido por KCN, sin embargo el 2,6 diclorofenolindofenol no acepta los electrones por sí solo sino que es el metosulfonato de fenazina el que acepa los electrones de la reacción de lasuccinato deshidrogenasa y posteriormente los lleva al 2,6 diclorofenolindofenol el cual pasa de un color azul (oxidado) a incoloro (reducido).





2,6 diclorofenol-indofenol: Aceptor electrónico artificial de electrones.

KCN: Inhibidor del complejo IV
Succinato deshidrogenasa:


















RESULTADOS
Tabla 1. Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E....