ciencia

Universidad Autónoma de México
Instituto de Biotecnología

MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS EN
BIOTECNOLOGÍA

ESPECTROFLUORIMETRÍA


_NDICE
Antecedentes históricos
Física y química
Absorción de la luz
Naturaleza de los estados excitados
Población de los estados excitados
Desactivación del estado excitado
Relajación vibracional
Conversión interna: no radiativa
Fluorescencia
Cruzamientointersistemas
Transferencia de la energía de excitación sin radiación
Apagamiento colisional
Transferencia no colisional
Reacciones químicas
Características y parámetros de la fluorescencia
Espectro de fluorescencia
Eficiencia cuántica
Tiempo de vida de radiación
Anisotropía de fluorescencia
Fluorescencia de estado estable y resuelta en tiempo
Fluoróforos
Efectos del solventeEspectrofluorímetros
La fuente de luz
Componentes de excitación de la muestra
Selectores de longitud de onda
Calibración de los monocromadores
Filtros ópticos
Compartimiento de la muestra
Efecto de la geometría de la muestra
Detectores
Contador de fotones contra detección análoga
de fluorescencia
Desviaciones de la ley de Lambert-Beer
Dispersión de la luz
Fluorescencia
Agregados
Análisis dedatos
Definición de sensibilidad
Conversión entre longitud de onda y número
de onda
Curvas de calibración
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Datos del espectro
Corrección de los espectros de fluorescencia
Eficiencia cuántica
Problemas químicos
Compuestosfluorescentes de referencia
Medio
Impurezas e interferencia
Apagado
Fotólisis
Efecto de la temperatura
Adsorción
Aplicaciones
Fluorescencia de proteínas
Fusión de membranas
Citómetro de flujo
Secuenciación de DNA
PCR en tiempo real
Bibliografía
Apéndice

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ESPECTROFLUORIMETR_A
La espectrometría defluorescencia o espectrofluorimetría es el método
espectroscópico óptico más extensivamente usado en mediciones analíticas y en
investigación científica. El gran número de aplicaciones va desde la determinación
analítica de trazas de metales en el ambiente a mediciones de pH en células completas
bajo condiciones fisiológicas. En la investigación en laboratorio, la espectrofluorimetría se
está aplicandopara estudiar procesos físicos fundamentales de moléculas; relaciones
estructura-función e interacciones de biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos;
secuenciación de DNA y caracterización genómica. En aplicaciones analíticas, el uso de
la fluorescencia es dominante en laboratorios clínicos donde inmunoensayos de
fluorescencia han reemplazado ampliamente a los radioinmunoensayos.
Haydos razones principales para el extensivo uso de la espectrofluorimetría. La
primera, es el alto nivel de sensibilidad y el amplio rango dinámico que pueden realizarse.
Un gran número de laboratorios han reportado detección de una sola molécula. En
segundo lugar, la instrumentación requerida es conveniente y para la mayoría de
propósitos puede adquirirse por un costo no muy elevado.ANTECEDENTES HISTÓRICOS
Sir John Frederick William Herschel (1792-1871) hizo la primera observación de
fluorescencia de una solución de quinina vista a la luz del sol, y la describió en “On a Case
of Superficial Color Presented by a Homogeneous Liquid Internally Colorless” en
Philosophical Transactions of the Royal Society of London (1845) 135:143-145.
En su primera descripción, Herschel reconoció lapresencia de un fenómeno
inusual, el cual no pudo explicar con el conocimiento científico de aquella época. En
estos días, la fluorescencia de la quinina permanece como uno de los ejemplos de
fluorescencia más usados.
Es interesante hacer notar que el conocimiento del primer fluoróforo, quinina, fue
responsable de estimular el desarrollo del primer espectrofluorímetro, el cual apareció en...