Cinética de alfa-amilasa

TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO Nº 1
Cinética Enzimática. Determinación de la Actividad Enzimática de α-amilasa en la Hidrólisis de Almidón.

RESUMEN
El siguiente práctico se realizó con el objetivo de determinar experimentalmente los parámetros cinemáticos de la ecuación de Michaelis-Menten para la hidrólisis de almidón catalizada por la enzima α-amilasa. Para lograrlo, el método utilizadoconsistió en medir las absorbancias del complejo yodo-almidón para diferentes concentraciones de almidón hidrolizadas parcialmente en el tiempo. Con los datos obtenidos se realizó el ajuste de curvas y las gráficas velocidad inicial vs concentración de sustrato y de doble recíproca. Mediante éstas se obtuvo que la constante Km para α-amilasa frente a almidón a 37 ºC y pH de 5,6 es de 2,2 g/L, y lavelocidad máxima de la reacción es de 0,0356 g/L seg. Se pudo concluir que la enzima en estudio cumple la ecuación de Michaelis-Menten y que las condiciones de operación influyen mucho en la hidrólisis enzimática.

OBJETIVOS
La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismospor los cuales transcurren.
La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:
Por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo.
Por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo.
El objetivo de esta práctica es determinar la actividad enzimática de α-amilasa en función de la concentración de sustrato (S), específicamente en su acción sobre los enlaces α(1-4) del almidón. Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón en el tiempo mediante el seguimiento de la reacción de color que produce el mismo con el iodo en disolución de ioduro de potasio (Reactivo de Lugol).
Específicamente determinaremos los parámetros cinéticos, velocidad máxima (Vmáx) y constante de Michaelis-Menten (Km).

INTRODUCCIÓN
El almidón es la mayor reserva deenergía en las plantas y el principal carbohidrato en la dieta humana. Es la segunda fuente de carbohidratos más importante (luego de la celulosa). Se presenta con forma de gránulos (Figura 1) de diferentes tamaños (desde 1 hasta más de 100 μm de diámetro) y formas . Su densidad es aproximadamente 1500 kg/m3. Los gránulos de almidón natural son insolubles en agua fría y frecuentemente resistentes atratamientos químicos y enzimáticos , debido a que sus constituyentes (polisacáridos) están densamente empaquetados por medio de enlaces hidrógeno inter e intramoleculares.
El almidón consiste en dos polisacáridos: amilosa (20-30%) y amilopectina (70-80%), su proporción puede variar dependiendo de la fuente de origen (Tabla 1). La amilosa está constituida esencialmente por cadenas lineales deglucanos con enlaces α (1-4), como puede observarse en la Figura 2; la amilopectina es una molécula ramificada que contiene entre 4-5% de enlaces α (1,6). Ésta produce una estructura en racimo característica (Figura 3).
Amilosa Amilopectina
Maíz 25 75
Tapioca 17 83
Papa 20 80
Trigo 25 75
Arroz 19 81

Los gránulos del almidón están formados por anillos de crecimiento semicristalinos y amorfosalternados (Figura 1), que tienen un espesor entre 120 y 400 nm . La cristalinidad es el resultado de la formación de hélices dobles entre las cadenas exteriores de amilopectina y las cadenas de amilosa - . Las capas amorfas están formadas por puntos ramificados de amilopectina.
La amilosa no es verdaderamente soluble en agua, pero forma micelas hidratadas que dan un color azul con el iodo. Entales micelas la cadena polisacárida está retorcida, constituyendo un arrollamiento helicoidal, como se observa en la figura 5. Los iones tri-ioduro I3- en solución se introducen en la hélice de amilosa dando lugar al complejo coloreado . La cadena de amilosa debe ser lo suficientemente larga para poder formar el complejo, de otra forma no lo producen. La actividad enzimática se determina...