cinetica enzimatica

OBJETIVOS

• Extraer la ureasa a partir de leguminosas, tales como soya o fríjol.
• Analizar el efecto producido sobre la actividad de la ureasa por parte de los iones Ag+, Hg2+ y Cu2+
• Determinar el pH óptimo de la ureasa al hidrolizar una solución de urea.

INTRODUCCIÓN

LA UREA
Como producto de la descomposición de proteínas y ácidos nucleicos, la gran mayoría de los organismosgeneran residuos nitrogenados, como la urea, dicho compuesto es producido a nivel hepático y constituye la principal forma de excreción del nitrógeno debido a propiedades como su alta solubilidad en agua y a la baja toxicidad de ésta respecto a otra forma de producto nitrogenado como el amoniaco.
En 1828 a partir de compuestos inorgánicos como el cianato de plomo y el hidróxido de amonio,Friedrich Wöhler sintetizó urea cambiando un paradigma de la “fuerza vital” según el cual los compuestos orgánicos solo podían ser sintetizados de manera natural por organismos vivientes.
¿Qué es la ureasa?
La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea a dióxido de carbono y amoniaco. Se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e invertebrados. En las plantas, la ureasa es un hexámero(consiste en seis cadenas idénticas) y se encuentra en el citoplasma. En bacteria, consiste en dos o tres subunidades diferentes. Para su activación, la ureasa necesita unir dos iones de níquel por subunidad. La acción catalítica de la ureasa está representada en la siguiente reacción:

Esta enzima conserva una especificidad absoluta sobre e sustrato urea en su mecanismo de hidrólisis. Se hadeterminado la presencia de los grupos sulfidrilo (SH) como participante de la forma activa de la enzima. La acción de los iones Ag+, Hg2+ y Cu2+ permiten la inhibición de la enzima al actuar sobre los grupos sulfidrilo, según se indica en la siguiente reacción:

Se sabe que la ureasa de la hoja ayuda a reciclar el nitrógeno de las proteínas (las proteínas se descomponen para dar urea). En lassemillas, la ureasa hace lo mismo cuando los granos germinan. El amoníaco resultante de la reacción también puede proteger las células de la planta de patógenos - parece ser que la enzima de la planta es en sí misma es un insecticida.
Muchas especies de bacterias producen ureasa, incluyendo a la Helicobacter pylori, la bacteria responsable de la úlcera de estómago. De esta manera, el H. pyloriaumenta el pH del jugo gástrico de alrededor de pH 3 a un pH 7, el óptimo para su crecimiento. Una prueba disponible comercialmente para controlar el H. pylori detecta la presencia de ureasa en el aliento, y se utiliza como una herramienta para el diagnóstico de úlcera de estómago.
Los rumiantes tienen las bacterias para digerir la celulosa en su rumen (primer compartimiento de sus estómagos), con elfin de ayudarles a digerir su dieta vegetal. Estos animales excretan urea en esta parte del estómago, siendo la urea una excelente fuente de nitrógeno para el crecimiento bacteriano. Para asumir el nitrógeno, las bacterias secretan ureasa para descomponer la urea. Finalmente, los animales digieren la masa bacteriana

MATERIALES Y REACTIVOS
• Mortero
 • Tela o lienzo
• Baño de maría •Probeta
• Soya
 • Solución de NaCl 1%

• Soluciones Buffer a pH=5, 6, 7.2, 8.0 y 10 • Tubos de ensayo
• Agujas de jeringa • Erlenmeyers
• HgCl2 al 1% • HCl 0.1N y 0.045N
• Urea 0.25M

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Extracción de la ureasa

Pese 5g de soya previamente remojada y colóquela en un mortero, adicione 10 mL de NaCl al 1% y triture la mezcla hasta formar una pasta, luego filtrela suspensión con una tela o lienzo y centrifugue durante 5 minutos a 2500 rpm.
Transfiera el sobrenadante a una probeta, adicione al residuo 10 mL de NaCl 1% y repita el procedimiento anterior . Reúna los sobrenadantes y complete hasta 25 mL con solución de NaCl 1%.
2. Determinación del pH óptimo
Preparación de los tubos blanco:
A 5 tubos de ensayo adicióneles respectivamente, las...