Cinetica Enzimatica

TRABAJO PRACTICO Nº 4: CINETICA ENZIMATICA


INTRODUCCION

A temperaturas fisiológicas pocas o casi ninguna de las reacciones del metabolismo intermediario podrían ocurrir a una velocidad suficiente como para permitir el mantenimiento y crecimiento celular. Para que las moléculas reaccionen es necesario entregarles cierta energía adicional, llamada energía de activación (Ea). Unamanera de incrementar la velocidad de reacción es disminuyendo la Ea. Las enzimas son catalizadores biológicos que selectivamente disminuyen la Ea de reacciones químicas vitales.
El paso esencial en el estudio de una enzima es seguir la variación en el tiempo de la concentración de un reactivo (sustrato) o de un producto (medida de la velocidad) de la reacción catalizada. Los métodos analíticos que seusan dependen de la naturaleza de los sustratos y productos.

Métodos directos: En las reacciones biológicas existen frecuentemente diferencias espectrofotométricas medibles entre reactivos y productos por lo que pueden detectarse por este medio variaciones en la concentración de uno de ellos sin que el otro interfiera.

Métodos indirectos: Cuando el reactivo o el producto no absorben niemiten luz se los puede hacer reaccionar con otra molécula tal que el producto sea espectrofotométricamente o fluorométricamente activo. Para cuantificar fluorescencia se mide la emisión de luz por moléculas excitadas.

Métodos de titulación: En muchas reacciones enzimáticas se consumen o liberan protones, por lo tanto, un procedimiento general para seguir el transcurso de una reacción química esmedir la cantidad de ácido o de base requerida para mantener constante el pH.

Todas estas mediciones se pueden hacer en forma continua o discontinua en el tiempo. En este último caso, se toman alícuotas a distintos tiempos y se detiene rápidamente la reacción por inactivación de la enzima en condiciones que no alteren las concentraciones de sustrato y producto.

Objetivos:

1) Verificarexperimentalmente algunas propiedades de la reacción enzimática catalizada por la Fofatasa ácida de germen de trigo
1-a: Estimar la cantidad de enzima adecuada para realizar las mediciones en el tiempo del TP
1-b: Cuantificar la formación de producto en el tiempo a diferentes concentraciones de sustrato en presencia o ausencia de un inhibidor.
1-c: Estimar Km y Vm e identificar el tipo deinhibidor.

METODOLOGÍA

Reactivos:
Homogenato*: Se utilizará como extracto enzimático el homogenato de germen de trigo preparado en el primer trabajo conservado a - 20 oC.
-Buffer acetato 0,2 M pH 5,0 (buffer a pH óptimo para la reacción enzimática)
-KOH 0,1 M (medio alcalino para detener la reacción)
-pNPP 25 mM en acetato 0,2 M pH 5 (Sustrato en buffer de reacción)
-pNP 0.24 mM en KOH 0.1 N(producto para realizar la curva de calibración)
-fosfato de sodio (NaH2PO4) 100 mM pH 5,0 (inhibidor)



PLAN DE TRABAJO


1º Día:
- Confección de la curva de calibración para la detección espectrofotométrica del producto.
- Realización de curvas de tiempo para distintas concentraciones de enzima.

Curva de Calibración

|Tubo nº |0,24 mM pNP en OH-|H2O |0,1 N KOH |
| |(ml) |(ml) |(ml) |
|1 |- |3 |3 |
|2 |0,1 |3 |2,9 |
|3 |0,25|3 |2,75 |
|4 |0,5 |3 |2,5 |
|5 |1 |3 |2 |
|6 |1,5 |3 |1,5 |
|7 |2...