Cinetica Enzimatica

CINETICA ENZIMATICA
Determinación de los parámetros cinéticos, efectos de la temperatura y el ph de la enzima lacasa

RESUMEN
Las lacasas son enzimas producidas principalmente por hongos ligninoliticos, que catalizan la oxidación de variedad de compuestos fenólicos y puede actuar sobre una amplia variedad de sustratos, así que se determinaron los parámetros cinéticos y los efectos de latemperatura y el pH sobre la actividad enzimática de la lacasa, empleando como sustrato ABTS.
PALABRAS CLAVES: Enzima, actividad enzimática, enzima, sustrato, enzima lacasa, espectrofotómetro, absorbancia, ley de Lambert-Beer.

INTRODUCCION
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica, las cuales tienen la propiedad de ser eficaces en pequeñas cantidades, aumentan la velocidad de lareacción y por ende disminuyen la energía de activación sin ser consumidas, durante estas reacciones la enzima se combina con el sustrato para formar un complejo enzima-sustrato , mediante una reacción reversible cuya energía de activación es menor que la efectuada sin enzima, para formar un producto y la enzima libre que puede ser reutilizada.
E+S↔ES→E+P
En la cinética enzimática, las dospropiedades de mayor importancia son: el tiempo que tarda una enzima en llegar a su punto de saturación y la velocidad máxima o actividad máxima que puede alcanzar la reacción catalizada por dicha enzima, de este modo la activad de una enzima se encuentra determinada por diferentes factores como lo son el pH, la temperatura, la concentración del sustrato y la concentración de la enzima, donde elcomportamiento de la enzima con respecto a la variación de cada uno de estas variables se determina manteniendo las otras variables constantes, y se evalúa con respecto al tiempo; es decir si se desea determinar la actividad enzimática con respecto a la temperatura es necesario mantener la concentración de sustrato y enzima constantes al igual que el pH.

Así que la velocidad de una reacciónenzimática se puede determinar en el laboratorio por medio de la disminución de la concentración de sustrato en el tiempo, o el  aumento de concentración del producto, lo cual se puede hacer debido a que la enzima no se consume en el proceso de catálisis de la reacción, por medio de espectrofotometría.

De este modo se determinaran los parámetros cinéticos, el efecto de la temperatura y el pH de laenzima lacasa, para lo cual se empleara un espectrofotómetro y posteriormente se aplicara la ley de Lambert Beer, la cual afirma que la cantidad de luz absorbida por una muestra depende de la concentración, el coeficiente de extinción que es una propiedad única de cada molécula y la longitud de la celda a la cual pasa el haz de luz.
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES:
* Tubos Ependorf
* TubosEpendorf tapa rosca
EQUIPOS
1. Dos baños de temperatura controlada
2. Espectrofotómetro
REACTIVOS
1. NaOH 1 N
2. NaOH 3 N
3. HCl 1 N
METODOS
Para determinar el efecto de la temperatura se adiciona 0.9 ml de solución ABTS 0.5 M y en otro tubo ependorf de tapa rosca se adiciona 1ml de extracto enzimático, posteriormente se colocan en el baño a temperatura controlada,permitiendo que los tubos permanezcan a la temperatura deseada por 10 min, transcurrido este tiempo se adiciona a la celda espectrofotométrica 0.9 ml de solución ABTS 0.5 M y posteriormente se adiciona 50 µL de la solución enzimática, se mezcla y rápidamente se realiza la lectura de absorbancia cada 10 segundos durante 2 minutos, a una longitud de onda de 420 nm. Procedimiento que se realizó a unatemperatura de 37 ᵒC, 61ᵒC y a temperatura ambiente que correspondía a 17ᵒC, obteniendo de este modo la tabla n.1, tabla n.2 y tabla n.3.
Para determinar el efecto del pH sobre la actividad se adiciona en una celda espectrofotométrica adiciona 0.9 ml de solución ABTS 5 mM, y luego se lleva a un pH acido por medio de la adición de ácido clorhídrico 1 N , se mezcla y verifica pH con papel...