Cinetica enzimatica

Cinética Enzimática
Practica N° 2


INTRODUCCION
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos ovenenos o potenciada por otro tipo de moléculas.
Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren a velocidad adecuada en presencia de catalizadores específicos, que son las enzimas (E). Toda reacción enzimática puede esquematizarse como sigue:

E + S E + P

Así, E se combina con un sustrato (S) que se transforma en un producto (P). El tiempo que tarda una determinadacantidad de sustrato en transformarse en producto es lo que caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad o actividad enzimática (v) que se define como cantidad de sustrato transformado o de producto formado en la unidad de tiempo.
Para muchas enzimas, la velocidad de catálisis varía con la concentración de sustrato (S) en la forma que muestra la siguiente figura.

La grafica del ladoizquierdo nos muestra como actúa la velocidad de la enzima en función del sustrato según la cinética de Michaelis – Menten. Al lado derecho tenemos la presentación de los dobles recíprocos de dicha cinética enzimática la cual nos facilita la obtención de datos exactos del Vmax y Km.

En este trabajo se trabajo con la fosfatasas alcalinas que son un grupo de isoenzimas que catalizan la liberación deácido fosfórico de algunos ésteres monofosfóricos, a un pH elevado:

R-O-PO3H2 + H2O R-OH + H3PO4

Existen diferentes fosfatasas alcalinas en los diferentes tejidos (hueso, riñón, hígado, placenta, tejido tumoral). La actividad fosfatasa alcalina presente en suero puede ser, por tanto, una mezcla de isoenzimas de los tejidos. Los niveles de fosfatasa alcalina en suero se ven elevadosen enfermedades óseas y hepáticas; fue la primera enzima del suero que se estudió en una enfermedad hepática y ha sido utilizada ampliamente para el diagnóstico diferencial de la ictericia, enfermedades óseas y en algunos procesos cancerosos.
La fosfatasa alcalina es un ejemplo de enzima cuya actividad puede ser medida por un método colorimétrico. Este se basa en la transformación de unsustrato, el pnitrofenilfosfato (p-NFP), en p-nitrofenol (p-NF), producto de color amarillo que en solución alcalina absorbe a 405 nm.

EXPERIMENTO 1

Resultados y discusión:

Tubo n°1:
Concentración hasta el paso de la enzima:
0.01mg/0.6ml = 0.017 g/l.
Cálculo de la molaridad del sustrato:
0.017 g/l / 371.1 g/mol = 0.046 mM.
Cálculo dela concentración del producto:
[P]=Abs x 405nm x 1cm/ 18300 M-1min-1
[P] = 0.046 x 405/18300= 1.018 mM
Cálculo de la formación de producto (velocidad):
[P]/tiempo (min) = 1.018 mM/ 10min = 0.1018 mM/min
Tubo n°2:
Concentración hasta el paso de la enzima:
0.025mg/0.6ml = 0.0416 g/l.
Cálculo de la molaridad del sustrato:0.0416 g/l / 371.1 g/mol = 0.11228 mM.
Cálculo de la concentración del producto:
[P]=Abs x 405nm x 1cm/ 18300 M-1min-1
[P] = 0.112x 405/18300= 2.124mM
Cálculo de la formación de producto (velocidad):
[P]/tiempo (min) = 2.124 mM/ 10min = 0.2124 mM/min

Tubo n°3:
Concentración hasta el paso de la enzima:
0.05mg/0.6ml = 0.083 g/l.
Cálculo dela molaridad del sustrato:
0.083 g/l / 371.1 g/mol = 0.2246 mM.
Cálculo de la concentración del producto:
[P]=Abs x 405nm x 1cm/ 18300 M-1min-1
[P] = 0.224x 405/18300= 3.563 mM
Cálculo de la formación de producto (velocidad):
[P]/tiempo (min) = 3.563mM/ 10min = 0.3563mM/min

Tubo n°4:
Concentración hasta el paso de la enzima:...