Cinetica Quimica

I. INTRODUCCIÓN
La medición de la velocidad de las reacciones enzimáticas comenzó en 1902, cuando Adrian Brown informó sobre una investigación acerca de la velocidad de la hidrólisis de la sacarosa cuando es catalizada por la enzima de la levadura invertasa (1); desde entonces, se ha vuelto una práctica muy importante para la caracterización de la actividad enzimática (2).
La cinéticaenzimática se encarga de estudiar la velocidad de cambio que tiene la concentración de los reactivos o de los productos por unidad de tiempo (3), de modo que las velocidades de reacción y la eficiencia de una enzima puedan cuantificarse (2). De esta forma se puede conocer la vía que seguirán los reactivos y por tanto, el mecanismo de la reacción, además de proveer una gran información sobre sufuncionamiento biológico, lo que facilitaría la aplicación de métodos farmacológicos terapéuticos que permitan modificar dicho mecanismo en caso sea necesario (2).
Este estudio se vale de herramientas como la ecuación de Michaelis-Menten y la de Linneweaver-Burk para la determinación de los mecanismos enzimáticos. Ambas ecuaciones parten a partir de los estudios de Adrian Brown, quien propuso que lareacción global se compone de dos reacciones elementales, en las que el sustrato (S) forma un complejo con la enzima (complejo ES), que luego se descompone en productos (P) y enzima (E) (1):
E+S ->(k1) <-(k1) ES -> (k2)<- P + E
En dicha ecuación química, la velocidad global de producción de ES es la diferencia entre las velocidades de reacciones elementales que llevan a cabo suaparición y las que conducen a su desaparición, de modo que se plantea una ecuación (1):
V=d(ES)/dt = k1 (E)(S) – k(-1) ES - k2 (ES)
Dicha ecuación no se puede integrar de manera explícita (1), es por esto que en 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten trabajan con el supuesto de que k-1>k2, logrando que el primer paso de la reacción alcance el equilibrio (1). Posteriormente, Briggs y Haldane proponen lasuposición del estado estacionario, donde d(ES)/dt=0 (1); de tal forma que se plantea la siguiente ecuación (2, 4):
k1 (E)(S) = k(-1) ES + k2 (ES)
Reordenando dicha ecuación, se define km, la constante de Michaellis-Menten (1, 2, 4):
(E) (S) / ES = k-1 + k2 / k1 = Km
Y de la misma forma, se plantea la ecuación de la velocidad inicial:
V0 = (d(P)/dt)t->0 = k2(ES) = k2(E)t (S) / (S) + km
Dedicha ecuación se puede obtener la Vmáx, que es cuando los centros activos de la enzima están saturados con el sustrato, es decir, cuando (ES) = (E)t (1, 2, 4):
Vmáx = K2(E)t
A partir de estas dos ecuaciones, se obtiene la ecuación de Michaellis-Menten, la ecuación básica de la cinética enzimática (1, 2, 4):
Vo = Vmáx (S) / (S) + Km
La constante de Michaelis-Menten (Km) representa laconcentración del sustrato para la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la máxima y varía ampliamente según la identidad e la enzima y la del sustrato, además de las condiciones de pH y temperatura del medio (1, 2, 4).
La gráfica obtenida de la ecuación de Michaellis-Menten, es una parábola que corresponde a la concentración de sustrato en función a la velocidad (Figura 1); y cuya asíntota verticalcorresponde a Vmáx, lo que impide determinar de manera exacta el valor de Vmáx y por defecto, el de Km, (3); es por esto que es necesario hacer una transformación lineal, utilizando las inversas de ambos valores. Es así que se obtiene la ecuación de Linneweaver-Burk:
(ecuación)
De dicha ecuación se obtiene una gráfica correspondiente a la de una recta (Figura 2), cuya pendiente es Km/Vmáx y cuyascoordenadas de origen son -1/Km y -1/Kmáx (3).

II. RESULTADOS

Experimento 1: Medida de los parámetros cinéticos de la enzima
Del experimento realizado se obtuvo la absorbancia de la solución de cada tubo, a partir de la cual se calculó la velocidad. Ambos resultados se resumen en la siguiente tabla (Tabla I):
Tabla I. Absorbancia y velocidad de acuerdo a la concentración del sustrato....