Cinetica y Actividad de β-galactosidasa

Laboratorio de Bioquímica
Informe n° V , VI
Cinetica y Actividad de β-galactosidasa


Profesor : Gustavo Faúndez
Integrantes: Cordero Claudia
Corrales Carla
Ferraro Valeria
Figueroa Jorge
LaraCamila
Fecha : 19 Agosto 2013
Sección : 02

Introducción
La β-galactosidasa es una proteína globular con actividad enzimática que se puede encontrar en la naturaleza tanto animal como vegetal y en microorganismos como hongos y bacterias. Además en la naturaleza es posible encuéntralas junto amuchas especies moleculares, pero es posible ubicarlas gracias a su acción catalizadora.
La β-galactosa hidroliza a la lactosa (sustrato natural) en sus monómeros glucosa y galactosa, al incidir el enlace galactosidico β- 1,4 del azúcar. Se sabe que la leche, por su alto contenido en lactosa, no puede ser asimilada por cierto grupo de personas, pues les ocasiona trastornos digestivos a causa deque no sintetizan beta-galactosidasa, a esto se debe el interés básicamente nutricional e industrial por esta enzima por parte de las industrias.
En este laboratorio estudiaremos la actividad y comportamiento cinético de la β- galctosidasa utilizando el sustrato cromógeno artificial o-nitrofenil-β-D-galactopiranosa, que es un compuesto incoloro, que es hidrolizado por esta enzima liberandogalactosa y orto-nitrofenol.
El orto-nitrofenol es de coloración amarilla y absorbe fuertemente en una longitud de onda de 420 nm (dependiendo del ph) por lo que la cantidad del producto formado puede ser determinado a través de la medición de la absorbancia en un espectrofotómetro y a partir de estas se puede determinar la velocidad de reacción como Δ[ONP] / Δt.
Como ya sabemos, durante lapurificación de una enzima, se debe determinar la cantidad de proteína presente en las distintas etapas del proceso (método de Bradford). Ya que la purificación de enzimas implica la remoción selectiva de otras proteínas, es de suma importancia establecer la cantidad de actividad enzimática relativa a la cantidad de proteína presente en cada etapa del proceso de purificación. La medida de la actividadenzimática por miligramo de proteína se denomina actividad específica, y puede ser utilizada para indicar el grado de pureza de la enzima en las fracciones obtenidas durante la purificación
Actividad específica = moles de producto formado / minuto
mg de proteína

A medida que una enzima sigue un proceso de purificación, su actividad específica aumentará hastallegar a un límite, que corresponde a la enzima pura.



Procedimiento
Curva de calibración de o-nitrofenol
Para poder determinar la velocidad de una enzima podemos medir el aumento de la concentración del producto en el tiempo. Un método frecuentemente usado consiste en medir la absorbancia del producto en un espectrofotómetro, pero para conocer la concentración debemos encontrar una relaciónentre estos dos parámetros. La forma más directa de hacerlo es elaborar experimentalmente una recta de calibración utilizando una serie de soluciones de concentración conocida del producto de la reacción, en este caso el o-nitrofenol.
A partir de la solución stock de o-nitrofenol (2 mM) preparar 7 soluciones de 2,5 ml en el rango 50-500 µM, agregando buffer 2x (1,25 ml) y agua destilada(adicionar volumen para completar 2,5 ml) de acuerdo a la Tabla 1. (Se debe calcular el volumen de solución stock de o-nitrofenol 2 mM que es necesario agregar en cada punto de la columna 2)
Una vez preparadas las soluciones leer en espectrofotómetro a 420 nm, y confeccionar con estos datos la curva de calibración

Determinación de la velocidad de reacción
En este paso determinaremos la velocidad...