Citometría de flujo

Citometría: Identificación de T-reguladores
Asignatura: Unidad de Investigación I

Introducción
El marcaje de T-reguladores por medio de la citometría de flujo se logra a través de la identificación de anticuerpos unidos a los T-reguladores, en este caso anti-CD25 y anti-FoxP3 [1], los cuales son identificados a través del citómetro.
El citómetro funciona por medio de una boquilla queextrae el contenido del tubo a analizar, en este caso células tratadas con diferentes anticuerpos para reconocer la presencia de T-reguladores. Por medio de dicha boquilla el citómetro alinea las células individualmente para que estas sean atravesadas por uno o más haces de luz. La fluorescencia emitida proporciona información sobre la célula, la cual pasa por una serie de filtros para que esta sealegible para la maquina ya que la luz emitida es un conjunto de haces con diferentes longitudes de onda, la luz que es desviada en 20° es analizada por un lente conocido como “canal de dispersión frontal” (FSC por su sigla en inglés, forward scatter channel). Este canal permite analizar el tamaño de las células, pudiendo diferencial las células vivas de las células muertas. Otro canal, llamado canalde dispersión lateral (SSC por su sigla en inglés side scatter channel) recibe la luz desviada en 90°, por medio de este se puede analizar la granulosidad de las células. Por medio de estos dos canales se puede analizar la información sobre grupos homogéneos de células en la muestra, dando como resultado colonias celulares.
Aparte del uso anteriormente mencionado, el citómetro también puedeanalizas diferentes tipos de fluorescencias según se le indique, para esto se pasan las células por un haz de luz, y mediante un rango “neutro” anteriormente establecido, se separan las células que emitan luz sobre ese rango establecido y así se podrá diferenciar los diferentes marcajes con anticuerpos que se quieran hacer.
Para la citometría se usaran diferentes substancias:
-ACK: solución tampónusada para lisar los glóbulos rojos de la muestra y estos no interfieran con el análisis final.
-Buffer IF: solución hecha de suero fetal bovino al 2% en PBS, es usado para bloquear la muestra, debido a su alto contenido de proteínas. Esto quiere decir que al estar en la muestra, las proteínas del buffer tendrán tendencia a unirse a las proteínas de las células presentes, estos se hace paraevitar que los anticuerpos se unan a proteínas que puedan mostrar cierto grado de afinidad, pero que no sean las indicadas para el estudio. Debe mantenerse siempre a 4°C y luego de su uso debe ser congelado.
-PFA: Se define como para-formaldehido, es una sustancia cancerígena por lo cual se debe trabajar con guantes. Es una sustancia que fija a las células por reticulación. Este tipo de fijación secaracteriza por la ruptura de los puentes de hidrogeno, por acción del fijador, y luego se forman una malla reticular por acción química entre los grupos activos del fijador, en este caso el grupo aldehído.
-Detergentes: Son sustancias que hacen poros en la membrana plasmática de la célula para facilitar el acceso de sustancias que no entrarían normalmente al citoplasma.

Métodos
Disección:Para evitar contaminación tanto el ratón como las herramientas deben ser limpiados con etanol, el ratón se sumerge completamente y las herramientas se limpian con ayuda de papel, en este caso se usarán una tijera y pinza grandes, y una tijera y pinza pequeñas. Para comenzar la disección se cubre la superficie con papel, y a este se le rocía etanol, luego se ubica el ratón de manera que su costadoizquierdo quede visible para realizar la incisión, esta se realiza ocupando el material de disección grande, primero se debe peinar la zona donde se realizara el corte que será sobre el muslo del ratón, para esto se rocía etanol y con ayuda de las pinzas se separa el pelaje dejando la piel visible, luego se afirma con ayuda de la pinza y se corta usando las tijeras, luego estas se introducen para...