Citometr a de flujo

Análisis del ciclo celular y apoptosis por citometría de flujo
Jesús Chaparro García

Resumen: partiendo de células de leucemia promielocítica humana cultivadas en presencia y ausencia de 2-metoxiestradiol se pretende deducir el efecto de dicho compuesto sobre el ciclo celular mediante citometría de flujo y análisis computacional de los resultados usando el software Summit.
Introducción
Lacitometría de flujo es una técnica de caracterización y recuento de eventos (células) atendiendo a sus propiedades morfológicas, todo gracias al efecto producido al entrar el evento en contacto con un láser. Gracias a ello, es posible aislar diferentes grupos celulares de una muestra compleja o estudiar la ploidía de los mismos, así como determinar la fase del ciclo celular en la que se encuentra undeterminado porcentaje de la población y la entrada en apoptosis. Esta técnica está siendo cada vez más usada en protocolos rutinarios para estudios de fármacos sobre distintos tipos celulares y las posibles aplicaciones de los mismos en terapias.
En la práctica hemos tratado de determinar cómo afecta una sustancia, el 2-metoxiestradiol, a células HL60 ensuspensión usando la citometría de flujo. Previamente al análisis por el citómetro se tratará ambas poblaciones de células (las que tienen en el medio el fármaco y las que no) con ioduro de propidio, agente intercalante en el ácidos nucleicos que emite fluorescencia, para poder medir la cantidad relativa de DNA frente al número de células analizadas. De esta forma, comparando los resultados obtenidos decada suspensión, podremos determinar si el compuesto induce la entrada en apoptosis de las células de leucemia o bien no interfiere con el ciclo celular.
Materiales y métodos
Materiales
* En el laboratorio: suspensión de células HL60 (dos, una de ellas -tratamiento- con 10 µM de 2-metoxiestradiol y otra sin eso -control-), PBS (1% FBS+10 mM HEPES), etanol 70% frío (a -20º C), solución de iodurode propidio 40 µg/ml y RNAsa 100 µg/ml y EDTA 50 mM. * En el aula de informática: programma Summit.
Métodos
En dos eppendorf distintos hay 100 µl de HL60, y en uno de ellos adicionalmente un tratamiento con 2-metoxestradiol. Cada tubo es rotulado segúncontenga este fármaco, de forma que "control" correspondería al eppendorf sin el compuesto y "tratamiento" al que sí lo tiene. El ioduro de propidio es impermeable a las membranas biológicas, por lo que no puede unirse estequiométricamente a los ácidos nucleicos. Por ello es imprescindible llevar a cabo una permeabilización inicial para asegurar la entrada del fluorocromo. Se pipetea 1 ml de etanol70% y se añade gota a gota y con agitación moderada a cada eppendorf, de forma que el etanol permeabilizará suficientemente las células y la agitación prevendrá la formación de agregados celulares que pudieran distorsionar la medida por el paso por el flujo laminar del citómetro. Tras ello, se dejan en incubación durante 1 hora en frío (-20º C).
Tras la incubación, los eppendorf de tratamiento ycontrol son centrifugados a 400g durante 5 minutos, para porteriormente retirar por decantación el sobrenadante (etanol fundamentalmente) y preservar el precipitado de células. Se resuspende dicho precipitado con 1 ml de PBS frío, tomando y soltando el volumen varias veces para asegurar que el botón de células se homogeniza en el seño del líquido. A continuación, se repite todo el proceso desdela centrifugación para un mayor lavado, y tras ello se vuelve a centrifugar y se retira nuevamente el sobrenadante por decantación en un vaso de precipitado.
El botón de células permeabilizadas que reside en el fondo del eppendorf se resuspende en 200 µl de PBS con ioduro de propidio 40 µg/ml y RNAsa 100 µg/ml (para asegurar que no hay intercalación con dicha biomolécula que interfiera en la...