citometria de flujo

Citometría de flujo.
La citometría de flujo es una herramienta de análisis que permite discriminar partículas de diferente tamaño y color. Esta técnica de análisis es utilizada de forma rutinaria en muchos laboratorios clínicos y de investigación para medir y cuantificar propiedades fenotípicas, bioquímicas y/o moleculares de células individualizadas mediante la utilización de sondasfluorescentes específicas de uno o varios parámetros celulares.
Es un método rápido, objetivo y cuantitativo de análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión (Orfao et al., 1995).
Esta técnica consiste en hacer pasar partículas en suspensión (por ejemplo células) por un haz luminoso. Las partículas deben estar alineadas y deben pasar de una en una por el hazluminoso. Su interacción con el haz luminoso genera señales debido a una dispersión de la luz (el tamaño de la célula, su núcleo, la membrana nuclear, el material granular del citoplasma, son características celulares que contribuyen a la dispersión de la luz), o a una emisión de la luz por los fluorocromos con los que se han marcado específicamente a las partículas. Estas señales generadas sonllevadas a unos detectores que las transforman en impulsos eléctricos, se amplifican y son transformadas en señales digitales. Un ordenador procesa estas señales digitales.

La citometría de flujo permite medir la cantidad de anticuerpo mono- clonal fluorescente unido a cada célula en forma individual, facilitando la identificación y tipificación de diferentes subgrupos de poblaciones celulares conuna extraordinaria sensibilidad, eficiencia y rapidez.
En el citómetro de flujo las células atraviesan un rayo láser y son analizadas individualmente. Las células deflectan o dispersan la luz de un láser de una forma estrechamente relacionada con su tamaño y granularidad que es registrada en un detector.
La molécula de fluorocromo unida al anticuerpo monoclonal absorbe luz del rayo láser y emiteluz en otra longitud de onda, en que su intensidad es captada por otro detector que está en ángulo recto al rayo. Ambos fenómenos facilitan la correcta identificación de las poblaciones celulares.




Reactivos para citometría de flujo
Las moléculas asociadas a las células pueden ser reconocidas por anticuerpos u otras proteínas, como son lectinas, hormonas, avidina o estreptoavidina, entreotras. También el DNA o RNA son susceptibles de ser visualizados con reactivos fluorescentes. Esto es la base de la versatilidad de la citometría de flujo. Así, aunque las mediciones de FSC y SSC permiten identificar tipos celulares dentro de una población heterogénea, son realmente las sondas fluorescentes las que nos permiten clasificarlas con positiva de fluorescencia en una célula que contiene1000 partículas del fluorocromo cuando se la compara con la fluorescencia basal o autofluorescencia de las células.
El fluorocromo más utilizado en microscopía y citometría de flujo es isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las ventajas que FITC ofrece por sobre otros fluorocromos son: su alto coeficiente de extinción, su eficiencia cuántica y sus características de absorción y emisión máxima,óptimas para trabajar con láser de Argón y lámparas de Mercurio. Además, se pueden obtener comercialmente una amplia variedad de
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anticuerpos y otras sondas conjugadas con FITC
3. APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
Aplicaciones comunes de la citometría de flujo:
        Inmunofenotipo
        Análisis del ciclo celular
        Genes reporteros
        Medida de la proliferacióncelular
        Apoptosis
        Flujo de calcio
        Señalización intracelular: detección de fosfoproteínas a nivel unicelular
        Ensayos Multiplexado de moléculas en disolución.


Las aplicaciones actuales de la citometría de flujo reposan esencialmente en la identificación y cuantificación de los antígenos expresados tanto en la membrana como en el citoplasma de las células...