Citometria

1.1.3.4. Citometria de Flujo
La citometría de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. La citometría de flujo es una tecnología (proceso) que permite la medida simultánea de múltiples características físicasde una sola célula. Estas medidas son realizadas mientras las células (partículas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido (1).

EL CITOMETRO NECESITA UN SISTEMA COMBINADO DE :
• Fluidos, para introducir y restringir las células para análisis
• Optica , una fuente de excitación y un sistema colección paragenerar y recoger las señales luminosas. El sistema de excitación consiste en un láser, lentes y prismas para dirigir el rayo. El sistema de colección consiste en espejos ópticos y filtros para encaminar determinadas longitudes de onda hacia detectores ópticos determinados.
• Electrónica, para convertir las señales ópticas en señales electrónicas proporcionales y digitalizarlas para análisiscomputacional.
SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo.

SISTEMA OPTICO: Láser (Argón con luz monocromática de 488nm , filtros , lentes y detectores.

SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.
Sistema opticoEl impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores.
PARAMETROS
Características Morfológicas de la célula : tamaño y complejidad del citoplasma
Características antigenicas de la célula : Inmunofenotipo.
PARAMETROS FISICOS
• Su tamaño relativo (forward scatter-FSC)
• Sugranularidad relativa o complejidad interna ( side scatter SSC).
FLUORESCENCIA RELATIVA (FL1, FL2, FL3)
• Determinación cuantitativa de características antigénicas, bioquímicas y biofísicas de células individuales (1,2).
OBJETIVOS PRINCIPALES DE
LA CITOMETRIA DE FLUJO
• Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas.
• Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones decélulas deseadas (por deflección electrostática ; esta tecnología de separación se llama "electronic cell sorting")
• Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas
COMO SE DETECTAN ESTAS CARACTERISTICAS
El citómetro de flujo detecta como las células interactúan con un rayo láser en términos de cómo la célula :
• desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC)
•emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2. FL3)(1).
LAS PROPIEDADES DE DISPERSION DE LA LUZ UNA CELULA NOS DA INFORMACION ACERCA DEL TAMAÑO CELULAR Y GRANULARIDAD
SEÑALES DE DISPERSION
Forward Scatter (FS) :luz dispersada frontalmente en ángulo cónico pequeño (0-10 grados ) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamaño de la partícula que produce la dispersión.
• La luz esdesviada a bajos ángulos entre 1 y 10 grados
• Generalmente proporcional al tamaño celular
• Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en dirección delantera
Side Scatter (SSC) : luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad de la estructura celular.
• Luz es desviada a altos ángulos
• Proporcional a la granularidad de la célula y su complejidad
• Detectadoa 90 grados del eje de luz incidente.

FLUORESCENCIA
Un fluorocromo es una molécula química que absorbe la luz a una determinada longitud de onda (ENERGIA ) energía de excitación y emite a una longitud superior (MENOR ENERGIA)
Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser. Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales ) para antígenos de la célula. La...