Citometría de flujo
Páginas: 19 (4735 palabras)
Publicado: 28 de noviembre de 2011
FUNDAMENTO
La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos pordistintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. Estos parámetros son:
- Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula, como su tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma.
- Parámetros relacionados con característicasantigénicas de cada célula (inmunofenotipo).
Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad.
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LECTURA
Las señales producidas por la interacción de las células con el haz de luz son de dos tipos:
- Señales de dispersión.
- Señales de fluorescencia.
a) Señales dedispersión: La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamental-mente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros deFlujo se miden dos fracciones de dispersión:
-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.
-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de lapartícula.
b) Señales de Fluorescencia: Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz deexcitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes decomplejos Antige-no/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula.
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CARACTERISTICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
La CMF es una técnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de muchos laboratorios clínicos y deinvestigación, capaz de proporcionar resultados de forma rápida que pueden ser aplicables al diagnostico. Gracias a su gran especificidad es capaz de distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes, y detectar una población celular en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares mayoritarias. Pero la principal característica de la CMF es que puede ofrecer información simultánea devarios parámetros de cada una de las células analizadas y la relación entre los parámetros de una célula y los de otra célula también analizada. Permite el análisis de dos parámetros de dispersión, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en equipos con un solo láser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en equipos con dos láseres.
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO...
La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos pordistintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. Estos parámetros son:
- Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula, como su tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma.
- Parámetros relacionados con característicasantigénicas de cada célula (inmunofenotipo).
Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad.
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LECTURA
Las señales producidas por la interacción de las células con el haz de luz son de dos tipos:
- Señales de dispersión.
- Señales de fluorescencia.
a) Señales dedispersión: La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamental-mente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros deFlujo se miden dos fracciones de dispersión:
-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.
-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de lapartícula.
b) Señales de Fluorescencia: Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz deexcitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes decomplejos Antige-no/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula.
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CARACTERISTICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
La CMF es una técnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de muchos laboratorios clínicos y deinvestigación, capaz de proporcionar resultados de forma rápida que pueden ser aplicables al diagnostico. Gracias a su gran especificidad es capaz de distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes, y detectar una población celular en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares mayoritarias. Pero la principal característica de la CMF es que puede ofrecer información simultánea devarios parámetros de cada una de las células analizadas y la relación entre los parámetros de una célula y los de otra célula también analizada. Permite el análisis de dos parámetros de dispersión, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en equipos con un solo láser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en equipos con dos láseres.
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO...
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