Citometría De Flujo

DEFINICIÓN
Un citómetro de flujo es un aparato capaz de medir componentes y propiedades de células o d partículas en suspensión.
HISTORIA
En los años 30 se describen los primeros contadores de células automatizados por Moldavan y Kielland ya en 1941.
En 1953, Crosland y Taylor realizaron una gran aportación al diseñar una cámara de flujo basada en la inyección de la muestra en el seno de unfluido de arrastre a través de un capilar.Asi se mejoraba el enfoque de la muestra y se evitaba la obstrucción del capilar.
En 1965 Kamentsky incorporo el uso de técnicas espectrofotométricas. Fue el primero que utilizó histogramas biparamétricos y desarrollo un sistema para separar selectivamente partículas en función de sus características citométricas. Este sistema se conoce como Sorterneumático.
Fulwyler desarrolla el Sorter electrostático basado en la tecnología de las impresoras de chorro de tinta.
Entre 1967 y 1969. Van Dilla describe el primer citómetro de flujo con configuración ortogonal (perpendicularidad de los ejes de iluminación, paso de muestra y detección de fluorescencia)
Durante los años 60 y 70 se desarrolla esta tecnología y se mejoran los instrumentos utilizados.En los años 80 existen la mayor parte de los avances importantes respecto a aplicaciones de la técnica en diferentes áreas científicas como biología, genética, zoología, botánica, etc.
FUNDAMENTO TEORICO
En un citómetro, las celular convenientemente procesadas y marcadas fluyen de forma alineada y sobre ellas incide un haz de luz, normalmente un laser. La luz que incide sobre las células sedispersa hacia delante y da una medida del tamaño de la partícula. La luz dispersada lateralmente da idea de la complejidad celular.
Si las células han sido previamente tratadas con fluorócromos (normalmente conjugamos a anticuerpos monoclonales que se une a alguna estructura característica de la célula), la interacción de la célula con el laser da como consecuencia la emisión de una luz queproviene del fluorócromo excitado. Esta luz dispersada lateralmente es seleccionada mediante espejos dicroicos y recogida en detectores adecuados, lo que permite realizar simultáneamente diversas mediciones de determinadas características celulares.
La citometría de flujo es muy objetiva, permite hacer mediciones celulares individuales, y tiene gran sensibilidad y resolución. Permite rapidez deanálisis, así como realizar múltiples mediciones simultáneas sobre una misma célula y, además, con los citómetros que tienen la función de sorter, se puede realizar la separación de poblaciones celulares con gran pureza.
FUNDAMENTO TECNICO
En este apartado vamos a describir las partes mecánicas que forman el citómetro.
Este aparato consta de tres partes principales:
* Sistema fluídrico
*Sistema óptico
* Sistema electrico
sistema fluÍdrico
En este sistema están incluidos dos fluidos. En uno de ellos hay una suspensión de la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle estabilidad. Este último se conoce como “sheath fluid” (cubierta de fluido). Las células pasan una a una por delante del haz del laser. Ambos fluidos son inmiscibles debido a diferencias de presión.
Lasdiferenciaciones mecánicas son las siguientes:
* Inyectores de la muestra: Es muy importante que la velocidad de flujo sea constante y adecuada a cada tipo de análisis. Hay inyectores de presión e inyectores isovolumétricos por jeringa que permiten contar las células, si bien su velocidad de flujo es menor. La mayoría de los citómetros utilizan los primeros.
* Camaras de flujo: Dependen de lafuente de iluminación del citómetro. Nos referimos solo a las cámaras para citómetros con fuente de luz laser.
Hay de dos tipos: Cerradas y abiertas.
* CERRADAS: Consiguen velocidades de flujo menores y un menor fondo lumínico, pero no permiten la realización de sorting, un proceso basado en la citometría de flujo en el que la separación celular mediante FACS(Fluorescence-activated cell...