Clonación de la secuencia que codifica para la proteína madura de la hormona humana del crecimiento

Universidad Autónoma de Nuevo León
Facultad de Ciencias Biológicas



FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LICENCIADO EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
INGENIERÍA GENÉTICA
Ejercicio Integrativo Tercer Parcial
Contestar los siguientes puntos con el fin de proponer una estrategia de clonación de la secuencia que codifica para la proteína madura de la hormona humana del crecimiento en el vector deexpresión pPIC9 del sistema de expresión de Pichia pastoris y una estrategia de producción y recuperación del medio de cultivo. Clave GenBank NM_000515.

1. (20 puntos) Proponer una estrategia experimental para la obtención de la secuencia a clonar, especificando los detalles experimentales según la propuesta. Además, indicar los resultados que se obtendrían. Presentar una descripción resumida conun esquema o diagrama de flujo (5 puntos), descripción detallada de protocolos con texto (10 puntos) y resultados esperados (5 puntos).


Protocolo
Obtención de la secuencia a clonar
Ingresar al GenBank, específicamente en la base de datos Nucleotide, e introducir en el apartado de búsqueda el número de acceso NM_000515.
Seleccionar a partir del apartado de Features del reporte en GenBanK delcDNA de la isoforma 1 de la hormona de crecimiento del humano (Homo sapiens) la región CDS (63…176).
Eliminar in silico la secuencia codificante del péptido señal de la isoforma 1 de la hormona de crecimiento humana (63…140) así como el codón de termino (TAG).
Cambiar in silico la secuencia nucleotídica resultante a los codones preferenciales de Pichia pastoris empleando BioEdit, para lo cuales necesario introducir el archivo en formato tab que contenga la frecuencia del uso de codones en Pichia pastoris.
Agregar in silico en el extremo 5’ de la secuencia nucleotídica resultante la secuencia codificante del péptido de activación del factor α, que a su vez incluye la secuencia diana de la enzima de restricción Xho I.
Agregar in silico en el extremo 3’ de la secuencia nucleotidicacodificante para el prepropeptido del factor α con los codones preferenciales de Pichia pastoris:
La secuencia codificante del sitio de reconocimiento de la proteasa KEX2
La secuencia codificante para poli Histidinas (6)
La secuencia codificante del sitio de reconocimiento de la enteroquinasa (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)
Posteriormente el codón de término de la traducción (UAA)
Finalmente el sitio dereconocimiento de la enzima de restricción EcoR I.
Enviar a sintetizar, mediante la tecnología de genes sintéticos, la secuencia nucleotídica a clonar a la compañía GenScript. La cual cobra $0.29/bp, por lo que el costo será de $170.23 USD por la síntesis del gen, mas $42 USD por gastos de envió. El tiempo de envió del pedido es de 10 a 12 días. El gen sintético es insertado en el vector pUC57,en el sitio de restricción EcoR V, específicamente una cantidad de DNA de 4 µg.

Resultado esperado
Secuencia nucleotídica a clonar:

CTCGAGAAAAGACATCATCATCATCATCATGATGATGATGATAAGTTTCCTACTATTCCT-
TTGTCTAGATTGTTTGATAACGCTATGTTGAGAGCTCATAGATTGCATCAATTGGCTTTT-
GATACTTACCAAGAATTTGAAGAAGCTTACATTCCTAAAGAACAAAAATACTCTTTTTTG-
CAAAACCCTCAAACTTCTTTGTGTTTTTCTGAATCTATTCCTACTCCTTCTAACAGAGAA-GAAACTCAACAAAAATCTAACTTGGAATTGTTGAGAATTTCTTTGTTGTTGATTCAATCT-
TGGTTGGAACCTGTTCAATTTAGATCTGTTTTTGCTAACTCTTTGGTGCTTCTGATTCTA-
ACGTTTACGATTTGTTGAAAGATTTGGAAGAAGGTATTCAAACTTTGATGGGTAGATTGG-
AAGATGGTTCTCCTAGAACTGGTCAAATTTTTAAACAAACTTACTCTAAATTTGATACTA-
ACTCTCATAACGATGATGCTTTGTTGAAAAACTACTGTTTTAGAAAAGATATGGATAAAG-
TTGAAACTTTTTTGAGAATTGTTCAATGTAGATCTGTTGAATCTTGTGGTTTTTAAGAAT-
TC

- Secuencia diana de Xho ISecuencia nucleotidica codificante del péptido reconocido por KEX2 del factor α
Secuencia codificante de la isoforma 1HGH
Secuencia codificante del sitio de reconocimiento de la enteroquinasa (Asp-Asp- Asp-Asp-Lys)
Secuencia codificante de las 6 Histidinas
Codón de término
Secuencia diana de EcoR I

2. (20 puntos) Proponer una estrategia experimental para clonar la secuencia anterior...