Clonación Lic

Clonación independiente de ligación (LIC)
La clonación independiente de ligasa (LIC) permite la clonación de productos de PCR sin la utilización de enzimas de restricción y reacciones de ligación.LIC es fácil de realizar y puede hacerse usando reactivos comunes que se encuentran en cualquier laboratorio de biología molecular, y por lo tanto no requiere la compra de un kit, pero es sinembargo muy eficiente. El principio de la estrategia de LIC se basa en las regiones de homología presente en los cebadores utilizados para la amplificación del producto de PCR y los extremos de un vectorde clonación linealizado.
El proceso consta de los siguiente pasos:
1. Diseño de los cebadores para la PCR con una región LIC
2. Elaboración de PCR para la amplicicación de el gen
3.Purificación de los productos de PCR
4. Creación de extremos 5’ protuberantes
5. Incubación del vector y el producto de PCR para su unión
6. Transformación
Los vectores de clonación seelaboran mediante el tratamiento con una exonucleasa, como la DNA polimerasa T4 o la exonucleasa III, en presencia de un único tipo de dNTP. Así debido a la actividad 3’-5’ exonucleasa, la enzima va aeliminar nucleótidos hasta encontrarse con el dNTP presente. Este proceso conduce a la formación de extremos protuberantes específicos en el vector, de un tamaño en torno a los 13-14 pb.
Por otrolado, los productos de PCR tendrán extremos protuberantes complementarios creados por la extensión en 5’ por parte de los cebadores.
El producto de PCR se purifica para eliminar los dNTps y se tratancon la DNA polimerasa T4 en presencia del apropiado dNTP para generar los extremos protuberantes compatibles con el vector.
Los extremos del vector y el producto de PCR son pegajosos y pueden unirsecon suficiente fuerza, sin necesidad de ligasa, dando lugar a una mólecula de DNA circular que contiene el inserto.
Finalmente, las células competentes pueden ser transformadas con el plásmido...