Clonación RF

Aplicaciones del método
de Restriction Free
cloning
para manipulación molecular y
expresión de proteínas

Autores
Tamar Unger
Yossi Jacobovitch
Ada Dantes
Reut Bernheim
Yoav PelegDepartamento de Biología Estructural, ISPC, Insituto
Weizmann, Israel.
Journal of Structural Biology, año 2010.

Sobre el método
Útil para insertar de manera precisa un
fragmento de ADN encualquier ubicación
deseada dentro de un plásmido circular.
Independiente de los sitios de restricción,
ligación o alteraciones en el vector o en el gen
de interés.

Sobre el método
Utiliza unfragmento amplificado por PCR
conteniendo un gen de interés como par de
primers para una reacción de amplificación
lineal dentro de un plásmido circular
Inserta genes completos sin introducir
residuosno deseados
Resulta conveniente para la expresión de
proteínas y la manipulación molecular

Desarrollo del método
Los autores, en el Centro de Proteómica
Estructural de Israel, adaptaron unaestrategia
de clonación independiente de la ligación.
Basándose en principios previamente
descriptos acerca de la integración de ADN
exógeno en un vector de expresión mediante
una amplificacióndel inserto y del plásmido.

El gen de interés es amplificado por PCR utilizando dos
primers, cada uno de los cuales contiene una secuencia
específica y una extensión 5’, solapando los sitios deinserción
deseados en el vector.
El producto doble cadena del PCR es utilizado como un set de
mega primers para la segunda reacción de amplificación. En
este caso, cada una de las hebras de ADNse aparea con el
vector en una posición predesignada y se extiende en una
reacción de amplificación lineal.
Las dos nuevas hebras de ADN forman un nuevo plásmido
doble cadena que no está cerrado.La hebra parental es
removida, y el plásmido recién sintetizado conteniendo el
inserto de ADN es introducido en células de Escherichia coli
en las cuales el ADN abierto es sellado por actividad...