clonacion

CLONACION MOLECULAR
Tema 7.4
Presenta: Maritza Payan Parra
197446

RESULTADOS DE APRENDIZAJE






Comprende y explica los elementos y
fundamentos de la clonación molecular.
Explica los procedimientos básicos
para la clonación molecular.
Conocer y discutir aplicaciones de la
clonación molecular en diferentes
campos y actividades humanas.

ERRORES FRECUENTES
Confundir la acción de las enzimas
que participan en la clonación.



No comprender el procedimiento de la
clonación molecular.

CLONACION DEL DNA


Comporta la separación de un gen
especifico o de un fragmento de DNA
de un cromosoma mucho mayor y su
unión a una pequeña molécula de
DNA portador, para después replicar
este DNA modificado miles o millones
de veces, mediante el aumentodel
numero de células y la creación de
múltiples copias del DNA clonado en
cada célula.

ELEMENTOS


-




Segmento de DNA
Vector
Plasmido
Porción del genoma de un virus
bacteriano ()
Célula
Enzimas

ENZIMAS UTILIZADAS EN LA
TECNOLOGIA DEL DNA
RECOMBINANTE
ENZIMA

FUNCION

Endonucleasas de restricción tipo II

Cortan el DNA en secuencias especificas

DNA ligasaUne dos moléculas o fragmentos de DNA

DNA polimerasa I (E. coli)

Rellena los huecos en el DNA duplex por adición
secuencial de nucleótidos en los extremos 3`

Transcriptasa inversa

Hace una copia del DNA a partir de una molécula de
RNA

Polinucleotido quinasa

Añade un grupo fosfato al grupo OH del extremo
5`de un polinucleótido para marcarlo o para permitir
su ligaciónTransferasa terminal

Añade colas homopolimericas al grupo OH del
extremo 3`de un duplex lineal

Exonucleasa III

Elimina nucleótidos de los extremos 5`de una hebra
de DNA

Exonucleasa del bacteriófago 

Elimina nucleótidos de los extremos 5`de un duplex
para exponer los extremos 3`monohebra

Fosfatasa alcalina

Elimina fosfatos terminales tanto del extremo
5`como del 3`(o deambos)

TIPOS DE
ENDONUCLEASAS
Las del tipo I cortan el DNA al azar.*
- Las de tipo III cortan el DNA a unos 25 pb de
la secuencia de reconocimiento.*
- Las de tipo II no necesitan ATP y cortan el
DNA en la misma secuencia de
reconocimiento.
* Se mueven a lo largo del DNA mediante un
mecanismo que requiere ATP
-

ESQUEMA BASICO
Vector + Fragmento de DNA
DNA Recombinante
Replicacióndel DNA recombinante dentro de
las células huésped
Aislamiento, secuenciación y manipulación del
fragmento de DNA purificado

CLONACION EN E. coli


-

-

E. coli fue el primer organismo utilizado y
todavía es la célula huésped mas común.
Tiene muchas ventajas:
Se conoce bien el metabolismo de su DNA.
Muchos vectores de clonación que se
encuentran asociados de manera natural,están bien caracterizados
Se dispone de técnicas efectivas para la
transferencia de DNA de una bacteria a
otra.

INTERACCION DE LA ENDONUCLEASA
DE RESTRICCION EcoRV CON SU
SECUENCIA DIANA




Se muestra la enzima unida a los productos de corte de DNA
en la secuencia reconocida por la endonucleasa.
La proteína se ha eliminado y el DNA se ha rotado 180. La
enzima crea extremosromos. Átomos de Mg en naranja.

1.

2.

3.

4.

5.

Cortar el DNA en lugares
determinados. Las endonucleasas
especificas de secuencia
(endonucleasas de restricción)
hacen las veces de tijeras
moleculares.
Selección de una pequeña molécula
de DNA capaz de autoreplicarse.
Vectores de clonación (plásmidos o
DNA vírico).
Unión covalente de dos fragmentos
de DNA: La ligasa une elvector de
clonación y el DNA que se desea
clonar.
Traslado del DNA del tubo de ensayo
a una célula huésped que
proporcionara la maquinaria
enzimática necesaria para la
replicación.
Selección o identificación de las
células huésped que contienen DNA
recombinante.

CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.

Los
fragmentos
pueden
ligarse a un
plasmido
...